МИКРОБИОЛОГИЯ

В учебном пособии рассмотрены основы морфологии и систематики микроорганизмов, влияние на них факторов внешней среды, пищевые заболевания, вызываемые патогенными организмами. Описаны источники инфицирования пищевых продуктов микроорганизмами, микробиология пищевых продуктов.

Предисловие

Микроорганизмы повсеместно распространены в природе, что является подтверждением их значимой роли в круговороте веществ биосферы и в жизни человека. Со времен седой древности и до наших дней человек использует деятельность микробов в ряде производственных процессов.

Специалисту биологу необходимо знать основы микробиологии, изучающей строение, жизнедеятельность, закономерности роста и развития микроорганизмов, их взаимодействие с внешней средой.

Микроорганизмы широко используются в пищевой промышленности в технологических процессах производства различных продуктов. На основе их жизнедеятельности основано производство кисломолочных продуктов, квашенных овощей, хлеба, вина и пива. От применения микроорганизмов в значительной степени зависят вкусовые качества пищевых продуктов. Микроорганизмы используются в получении многих биологически активных веществ: ферментов, витаминов, антибиотиков.

Однако наряду с полезной микрофлорой существует и группа патогенных микробов − возбудителей болезней человека. Многие из них являются возбудителями порчи различных пищевых продуктов. Микроорганизмы распространенны повсюду, этому способствуют их разнообразные потребности в пище, легкая приспособленность к условиям существования, высокая выносливость, способность к исключительно быстрому размножению.

ТЕМА № 1. Правила работы и устройство микробиологической лаборатории. Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препаратов. Простые и сложные методы окраски

Знание и неукоснительное соблюдение правил работы с различными группами микроорганизмов являются гарантией отсутствия случаев внутрилабораторных заражений, а изучение техники приготовления микроскопических препаратов является основой микроскопического метода исследования.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Ознакомление студентов с устройством микробиологических лабораторий, изучение правил работы в них, освоение техники приготовления и микроскопического исследования окрашенных препаратов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Определение термина «микробиология». Задачи, достижения и проблемы данной научной сферы. Связь микробиологии с другими дисциплинами.
  2. Принципы организации и оборудование микробиологической лаборатории.
  3. Правила работы в микробиологической лаборатории.
  4. Простые и сложные методы окраски бактерий.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Содержать рабочее место в порядке.
  2. Микроскопировать препараты, обнаруживать внутриклеточные включения, капсулы, элементы бактериальной клетки.
  3. Работать с помощью иммерсионного объектива биологического микроскопа, с фазово-контрастной установкой и в темном поле.
  4. Приготовить мазок-препарат, окрашенный простым способом по методам Грама, Циля − Нильсена.
  5. Приготовить препараты для микроскопического исследования микроорганизмов в живом состоянии.

Организация микробиологической лаборатории

Микробиологические лаборатории — это лаборатории, в которых выполняют различные микробиологические исследования. Существуют 3 типа микробиологических лабораторий:

  • клинико-диагностические — при больницах, диспансерах и поликлиниках:
  • санитарно-бактериологические — при санитарно-эпидемиологических станциях (СЭС);
  • ведомственные — при молочных, консервных заводах, мясокомбинатах, хлебозаводах, пивоваренных заводах, водонасосных станциях, станциях защиты растений и др.

Клинико-диагностические лаборатории проводят микробиологическую диагностику инфекционных болезней.

Лаборатории при СЭС осуществляют санитарный надзор на различных предприятиях, следят за санитарным состоянием помещений, оборудования, инвентаря, соблюдением правил личной гигиены персоналом, а на пищевых предприятиях — за соблюдением санитарных правил при технологической обработке, хранении, реализации, транспортировке пищевых продуктов.

Ведомственные лаборатории в зависимости от типа производства выполняют текущие анализы по внутрипроизводственному, входному и выходному контролю на микробную загрязнённость сырья, полуфабрикатов и готовой продукции, занимаются разработкой методов, обеспечивающих микробиологическую безопасность производства.

Выполняя микробиологические исследования, необходимо соблюдать следующие правила:

  • с инфицированным материалом работают только с помощью инструментов (пинцетов, петель, корнцангов и др.);
  • прикасаться руками к исследуемому материалу и конденсату в засеянных чашках запрещается;
  • перед работой тщательно проверяют целость стеклянной посуды, проходимость игл и надежность поршней шприцев;
  • при посеве материала делают надпись на пробирках, чашках Петри, колбах, флаконах с названием номера анализа (культуры) и даты посева;
  • в пробирки и чашки Петри материал высевают вблизи от огня горелки с обжиганием петли, шпателя, краев пробирки;
  • во время работы все чашки с посевами помещают в кюветы или на подносы, пробирки − в штативы;
  • растворы, содержащие патогенные микроорганизмы, набирают пипеткой с помощью резинового баллона;
  • насасывать ртом и переливать растворы из сосуда в сосуд через край нельзя;
  • по окончании работы запрещается оставлять на рабочих столах нефиксированные мазки, чашки Петри, пробирки и другую посуду с инфицированным материалом;
  • не разрешается выходить за пределы лаборатории в халатах и надевать их на верхнюю одежду.

Доставлять инфицированный материал в лабораторию и переносить его из одной лаборатории в другую на территории учреждения нужно в специально приспособленной посуде (металлических биксах, ящиках, баках).

В комнатах, предназначенных для обработки и посева инфекционного материала, нельзя проводить другие работы, выращивать цветы, держать домашних животных.

Принимать пищу, пить, курить, хранить продукты питания в помещениях, в которых работают с материалом, зараженным патогенными микроорганизмами или подозрительным на такое заражение, запрещается.

Центрифугирование инфекционного материала проводит специально обученный персонал. Если в процессе центрифугирования разбивается пробирка, содержащая инфекционный материал, центрифугу отключают от сети, выжидают время для того, чтобы осели капли аэрозоля, дезинфицируют, а загрязненные места очищают.

Термостаты и термостатные комнаты, предназначенные для выращивания патогенных микроорганизмов, дезинфицируют не реже одного раза в месяц.

При хранении инфекционных материалов в холодильнике необходимо принимать меры, предупреждающие его инфицирование. Оттаивание холодильника, предусмотренное правилами эксплуатации, нужно совмещать с его дезинфекцией.

В лаборатории обязательно должна быть укомплектованная аптечка для экстренной медицинской помощи, включающая этиловый спирт, настойку йода, перевязочные средства, набор необходимых антибиотиков.

Использованные при лабораторных исследованиях предметные стекла, пипетки, шпатели погружают на сутки в банки с дезинфицирующим раствором, затем моют и кипятят.

Отработанные чашки Петри и пробирки с посевами культур, посуду с использованным материалом, собирают в банки с крышками и стерилизуют паром под давлением.

Бактерицидные лампы включают только в отсутствие персонала.

Руки тщательно моют с туалетным мылом, вытирают вафельным полотенцем и смазывают защитным питательным кремом.

Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препаратов. Простые и сложные методы окраски

В связи с малыми размерами большинства патогенных микроорганизмов (не более 2-30 мкм) изучение их морфологии возможно только с помощью специальных оптических приборов, получивших название микроскопы (от греч. микрос − малый и скопейн − рассматривать, наблюдать). Они дают значительное увеличение и обладают высокой разрешающей способностью, то есть наименьшим расстоянием между двумя точками, дающими в поле зрения раздельное изображение.

Разрешающая способность человеческого глаза превышает 80 мкм. Размеры патогенных микроорганизмов меньше указанной величины, поэтому мы их не видим. Более того, микроорганизмы, расположенные друг к другу ближе 80 мкм, раздельно не воспринимаются. Современные микроскопы позволяют получать раздельное увеличенное изображение микроорганизмов и других объектов и структур, не доступных невооруженному человеческому глазу.

В настоящее время в практике микробиологических исследований используют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, исследовательский, электронный) и специальные методы микроскопии (темнопольный, фазово-контрастный).

Биологический микроскоп

Для микроскопических исследований применяют биологические микроскопы отечественных моделей: БИОЛАМ Р-11, БИОЛАМ Р-15, БИОЛАМ 17, БИОЛАМ С-11, БИОЛАМ П-1, БИОЛАМ И (микроскопы Р − рабочие, С − студенческие).

Современный биологический микроскоп — сложный оптический прибор, позволяющий изучать объекты в проходящем свете, в светлом и темном поле, а также в отраженном свете. Все эти микроскопы обеспечивают достаточно большое увеличение и высокую разрешающую способность (до 0,4 мкм).

Биологический микроскоп состоит из двух систем − механической и оптической (рис.1).

Механическая система микроскопа включает: штатив; колонку; тубус (съемный, наклонный − в современных моделях); подвижный предметный столик; макрометрический винт для грубой (ориентировочной) настройки на резкость; микрометрический винт, обеспечивающий тонкую фокусировку препарата; револьвер для объективов.

Оптическая система микроскопа содержит две части — осветительную и наблюдательную. Осветительная часть состоит из зеркала и конденсора с ирисовой апертурной диафрагмой. Зеркало имеет две отражательные поверхности — плоскую и вогнутую. С помощью конденсора лучи, идущие от зеркала, фиксируются и направляются на препарат. Яркость освещения регулируется ирисовой диафрагмой.

Устройство микроскопа

Рисунок 1. Устройство микроскопа: 1.окуляр, 2. насадка, 3. штатив, 4. основание, 5. револьверная головка, 6. объективы, 7. координатный столик, 8. предметный столик, 9. конденсор с ирисовой диафрагмой, 10. осветитель 11. переключатель (вкл./выкл.), 12. винт макрометрической (грубой) фокусировки, 13. винт микрометрической (точной) фокусировки

Оптическую часть микроскопа составляют объектив и окуляр. В микроскопах с наклонным тубусом имеется специальная призма, направляющая лучи под углом 450 к вертикали.

Объективы микроскопа отличаются сложным устройством и состоят из нескольких отдельных линз — фронтальной (нижней) линзы, увеличивающей объект, и коррекционных, исправляющих недостатки оптического изображения. Обычно применяют ахроматические объективы, в которых устранена хроматическая аберрация в отношении наиболее ярких цветов спектра (окрашивание изображения в различные цвета благодаря различной преломляемости лучей с различной длиной волны) и сферическая аберрация (нечеткое изображение периферических частей рассматриваемого предмета). Апохроматические объективы дают отчетливое, почти бесцветное изображение, поэтому они особенно эффективны при микрофотографировании (в них достаточно устранен остаточный хроматизм и достигнута равномерность резкости и величины изображения в лучах с разной длиной волны). Подобную оптику имеет БИОЛАМ Р-17 (объективы-апохроматы 10x, 20x, 60x, 90x МИ).

Объективы разделяют на сухие и иммерсионные (от лат. Immersio − погружение). Обычно биологические микроскопы оснащают двумя сухими объективами (8x и 40x) и одним иммерсионным (90x МИ), однако последние модели помимо указанных объективов оснащены более совершенной и разнообразной оптикой (БИОЛАМ Р-17 — апохроматами, БИОЛАМ И — планапохроматами ). Данные о каждом объективе обозначены на его оправе; к ним относятся: а) показатель увеличения x8, x40, x90; б) численная (нумерическая) аппертура; в) заводской номер объектива. Наряду с этими обозначениями иммерсионные объективы x90 (x100 БИОЛАМ И) имеют дополнительный буквенный индекс ОИ или МИ (объектив иммерсионный или микроскоп), а также черную маркировочную линию в нижней части объектива (рис.2).

Ход лучей в объективе с иммерсией

Рисунок 2. Ход лучей в объективе с иммерсией: 1-иммерсионное масло n=1,515; 2- фронтальная линза иммерсионного объектива; 3- предметное стекло n=1,52

Фронтальная линза иммерсионного объектива имеет короткое фокусное расстояние — 1,5-3 мм. При микроскопии ее погружают в каплю предварительно нанесенного на препарат иммерсионного масла, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла — 1,52. При этом устраняются неизбежные потери света при попадании в объектив.

Окуляры состоят из двух линз: верхней − глазной и нижней − собирательной. На оправе окуляров обозначено увеличение: x5 (22 мм), x7 (18 мм), x10 (13 мм), x15 (11 мм). Окуляры подобны лупе и лишь увеличивают изображение, полученное объективом микроскопа.

Общее увеличение микроскопа определяют произведением увеличений объектива и окуляра. Например, увеличение микроскопа с иммерсионным объективом x90 и окуляром x10 составляет: 90 х 10 = 900 раз. Полезное увеличение микроскопа может достигать 1500 раз, в повседневной же практике обычно используют увеличение порядка 630-900 раз.

Для полного использования разрешающей способности микроскопа необходимо хорошо знать его устройство и, прежде всего, правильно осветить исследуемый объект. Освещение объектов может быть осуществлено естественным (дневным) или искусственным светом (БИОЛАМ Р-11, БИОЛАМ Р-15, БИОЛАМ Р-17, БИОЛАМ С-11), во многих моделях микроскопов предусмотрено исследование объектов только при искусственном свете, так как они оснащены встроенным осветителем, в котором источником света являются лампы КГМН 6-30 (БИОЛАМ П-1), КГМ 9-70 (БИОЛАМ И) и КГМ 6-20 (ЕС БИМАМ Р-11, ЕС БИМАМ Р-13, ЕС БИМАМ Р-31). При повседневной работе целесообразно пропускать искусственный свет через матовый светофильтр конденсора.

В настоящее время фирмой «ЛОМО» (Санкт-Петербург) выпускаются так называемые микровизоры (рис. 3), то есть микроскопы, у которых вместо окуляра присутствует цветной телевизор, что дает, во-первых, возможность оцифровывать изображение на компьютере, а во-вторых, просматривать изображение одновременно нескольким лицам.

Микровизор

Рисунок 3. Микровизор

При работе с микроскопами, у которых встроенный источник света отсутствует, рекомендуется использовать следующие приемы в определенной последовательности.

  1. Подготовить микроскоп для работы: взять зеркало с плоской поверхностью (вогнутое зеркало применяют очень редко, как правило, при работе с объективами малых увеличений и без конденсора), конденсор поднять в верхнее положение до упора, диафрагму конденсора полностью открыть, поворотом револьвера включить сухой объектив (40х0,65), поставить матовый светофильтр.
  2. Исследуемый препарат установить на предметном столике и закрепить специальными клеммами.
  3. Повернуть зеркало таким образом, чтобы поле зрения микроскопа было освещено наиболее ярко.
  4. Поднимая или опуская тубус макрометрическим винтом, найти плоскость препарата и при необходимости рассмотреть его под малым увеличением.
  5. Поворотом револьвера включить иммерсионную систему (объектив 90х1,25) и на препарат нанести каплю иммерсионного масла.
  6. Под контролем глаза осторожно погрузить объектив в масло.
  7. Проверить освещенность поля зрения и наклоном зеркала улучшить освещенность препарата.
  8. Вращением макрометрического винта произвести грубую фокусировку изучаемого препарата.
  9. Детали исследуемого объекта рассмотреть, вращая микрометрический винт.
  10. Яркость освещения объекта отрегулировать только диафрагмой конденсора (не рекомендуют с этой целью менять положение конденсора). При смене препаратов операции с первой по пятую повторяют.

При работе со специальными осветителями (типа ОИ-32, ОИ-35 и др.) нужно поступать следующим образом.

  1. Микроскоп подготовить к работе обычным порядком. Зеркало взять с плоской поверхностью.
  2. Осветитель установить перед микроскопом с помощью соединительной планки, прилагаемой к осветителю, или, если ее нет, на расстоянии 20 см от зеркала.
  3. Световой поток направить на зеркало, для чего корпус осветителя необходимо наклонить.
  4. Закрыв диафрагму осветителя и перемещая патрон лампы вдоль оси, добиться четкого изображения ее нити на закрытой диафрагме конденсора.
  5. На предметный столик микроскопа установить и укрепить клеммами препарат.
  6. Открыв диафрагмы конденсора и осветителя при малом или среднем увеличении (объективы х8 или х40), найти оптическую плоскость препарата.
  7. Закрыв диафрагму осветителя и слегка передвигая зеркало, установить изображение диафрагмы осветителя в центр поля зрения микроскопа.
  8. Перемещая конденсор микроскопа по вертикали, получить наиболее четкое изображение границ диафрагмы осветителя. После этого конденсор не подлежит передвижению. Освещение препарата можно уменьшить при помощи диафрагмы конденсора.
  9. Под контролем глаза раскрыть диафрагму осветителя, пока свет не зальет почти полностью поле зрения микроскопа. Дальнейшее раскрытие диафрагмы осветителя не улучшает освещения исследуемого объекта.
  10. На препарат нанести каплю масла, на тубусе установить иммерсионный объектив, отрегулировать освещение исследуемого объекта и приступить к микроскопии.

Точное исполнение изложенных приемов настройки освещения по Келеру является необходимым условием при специальных исследованиях (микрофотографии, установке фазово-контрастного устройства и т. д.).

Иммерсионный микроскоп содержат в чистоте и предохраняют от механических повреждений. При соблюдении этих требований микроскоп может безотказно работать продолжительное время. После работы с объектива обязательно удаляют иммерсионное масло.

Дополнительные приспособления к биологическому микроскопу

Дополнительные приспособления позволяют максимально использовать все возможности биологического микроскопа, облегчают условия работы и значительно расширяют диапазон его применения. В микробиологии наиболее часто применяются следующие приспособления.

  1. темнопольные конденсоры: кардиоид-конденсор и параболоид-конденсор;
  2. фазово-контрастные приспособления: КФ-4 и другие модели;
  3. бинокулярные насадки: АУ-12 и другие модели, которые приближают микроскопию к условиям естественного зрения. Многие модели микроскопов имеют собственные бинокуляры: БИОЛАМ Р-15, БИОЛАМ Р-17, БИОЛАМ П-1;
  4. осветители: ОИ-32, ОИ-35 и другие модели. Источники искусственного света обеспечивают оптимальное и стабильное освещение, интенсивность света в них регулируют реостатом;
  5. микрометры: окуляр-микрометр и объект-микрометр, которые используют для измерения микроскопических объектов;
  6. нагревательный столик, который устанавливают вместо предметного и таким образом обеспечивают постоянную температуру 37 0С; применяют для длительного наблюдения за живыми микроорганизмами;
  7. рисовальный столик, который используют для высококачественной зарисовки препарата; с его помощью можно одновременно видеть изображение объекта и бумаги, расположенной на столе вблизи микроскопа, и обводить на бумаге контуры объекта;
  8. оптические светофильтры: цветные и нейтральные; их устанавливают между источником света и микроскопом и применяют при микрофотографии и специальных методах микроскопии;
  9. микрофотонасадки: МФН-11, МФН-12 и другие модели, их используют для фотографирования микроскопических объектов;
  10. микрокиноустановки, предназначенные для цейтраферной (прерывистой) микросъемки в сочетании с фазово-контрастной микроскопией; они позволяют изучить динамику роста и размножения микроорганизмов, влияние на них разных факторов и многие другие вопросы.

Микроскоп с конденсором темного поля

В микробиологии нашел применение микроскоп с конденсором темного поля. Его используют для повышения контрастности изображения, что имеет большое значение для изучения подвижности бактерий, которые в живом состоянии слабоконтрастны и не видны в обычном микроскопе.

Микроскопия в темном поле основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля − свечение пылинок в воздухе темного помещения, в которое солнечный луч проникает через небольшую щель).

Для создания темного поля в биологическом микроскопе применяют: щелевой метод, затемнение в объективе, специальные конденсоры − параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор, которыми заменяют конденсор в биологическом микроскопе.

Параболоид-конденсор имеет в центре затемнение, задерживающее центральные лучи света, и внутреннюю вогнутую зеркальную поверхность для отражения краевых лучей. В кардиоид-конденсоре лучи вначале отражаются от выпуклой зеркальной поверхности, затем от вогнутой. Краевые лучи, выходящие из темнопольного конденсора, проходят в косом направлении и не попадают в объектив, поэтому поле зрения микроскопа остается темным. В объектив попадают лучи, отраженные от объекта, в связи с чем в поле зрения можно наблюдать характерное изображение — на темном поле зрения ярко светятся микробные клетки и другие частицы, находящиеся в препарате.

В качестве источников света для микроскопа с конденсором темного поля используют сильные осветители (ОИ-32, ОИ-35). Настройку освещения и установку препарата («раздавленная капля») производят, руководствуясь изложенными выше правилами работы с биологическим микроскопом. Рекомендуется употреблять сухие объективы и предметные стекла толщиной 0,8-1,2 мм. Работа с темнопольным конденсором осуществляется в определенной последовательности.

  1. После настройки освещения и установки препарата обычный конденсор заменяют темнопольным.
  2. На верхнюю линзу опущенного конденсора наносят каплю жидкости (кедровое масло, дистиллированную воду), поднимают его вверх до тех пор, пока эта капля не коснется предметного стекла и не распространится по нему.
  3. Вращением макрометрического и микрометрического винтов производят фокусировку изучаемого препарата, при этом в поле зрения должно появиться светлое кольцо с темным пятном посредине.
  4. Поднимают конденсор до появления светлого пятна (если форма светлого пятна или кольца неправильная, значит капля иммерсионной жидкости мала).
  5. Винтами конденсора выводят пятно в центр поля зрения и приступают к исследованию.

При работе с иммерсионными объективами необходимо для уменьшения апертуры объектива внутрь него вложить специальную диафрагму, имеющуюся в наборе конденсора темного поля. При смене объективов конденсор дополнительно настраивают винтами.

Фазово-контрастный микроскоп

Метод фазового контраста позволяет наблюдать слабоконтрастные биологические объекты (микроорганизмы, растительные клетки) в неокрашенном состоянии, получая при этом контрастное их изображение. В отличие от микроскопа с конденсором темного поля, выявляющего лишь контуры объекта, метод фазового контраста позволяет увидеть элементы внутренней структуры рассматриваемого прозрачного объекта.

Известно, что качество микроскопии во многом определяется контрастностью объектов, которые в зависимости от светопоглощения подразделяются на амплитудные и фазовые.

Амплитудные объекты характеризуются различным светопоглощением, поэтому они изменяют амплитуду (интенсивность) проходящего через них света. К амплитудным объектам относятся все окрашенные препараты, которые изображаются с большим или меньшим контрастом.

Фазовые объекты имеют одинаковое светопоглощение на разных участках, но отличаются оптической плотностью. При прохождении света через такие объекты амплитуда его не меняется, а изменяется фаза колебания, что не фиксируется глазом. К фазовым объектам относятся живые неокрашенные микроорганизмы, изображение которых в обычном микроскопе отличается малой контрастностью.

Фазово-контрастный микроскоп дает возможность преобразовывать фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, в амплитудные, в результате чего даже прозрачные микроорганизмы становятся видимыми. Прозрачные биологические объекты при фазово-контрастной микроскопии характеризуются достаточно высокой контрастностью — в зависимости от фазовой пластинки они могут давать темные изображения на более светлом поле (явление положительного фазового контраста) или же светлые изображения на темном поле (явление отрицательного фазового контраста). Тип прибора обычно указан в его паспорте.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное приспособление КФ-4, в комплект которого входят следующие предметы:

  • объективы с фазовым кольцами, изменяющие фазу и уменьшающие амплитуду световой волны. На их оправе обозначен дополнительный индекс «Ф» − Ф х 10, Ф х 20, Ф х 40, Ф х 90;
  • фазовый конденсор с револьвером кольцевых диафрагм для каждого объектива. Индексом «О» обозначено отверстие с ирисовой диафрагмой для наблюдения препарата обычным методом;
  • вспомогательный микроскоп малого увеличения, которым заменяют окуляр при наблюдении за настройкой освещения.

При фазово-контрастной микроскопии используют осветители типов ОИ-32 или ОИ-35.

Для исследования методом фазового контраста готовят влажные препараты типа «раздавленная капля». Для этой цели желательно отбирать тонкие стекла. Для длительного наблюдения покровное стекло по краям закрепляют вазелином.

Последовательность работы с фазово-контрастным устройством следующая.

  1. Заменяют конденсор микроскопа специальным фазово-контрастным конденсором и устанавливают его таким образом, чтобы при подъеме фронтальная линза находилась на уровне предметного столика. Револьвером включают кольцевую диафрагму «О».
  2. Обычные объективы заменяют фазовыми.
  3. Помещают препарат на предметный столик микроскопа.
  4. Макрометрическим винтом добиваются точной фокусировки на плоскость исследуемого препарата.
  5. Устанавливают освещение по правилам Келера, которые изложены выше, после чего в положении осветительной лампы, зеркала и конденсора никаких изменений не допускается.
  6. Вместо окуляра вставляют вспомогательный микроскоп. Перемещая окуляр вспомогательного микроскопа внутри тубуса, получают четкое изображение фазового кольца. В этом положении окуляр фиксируют винтом.
  7. Вращая револьвер конденсора, включают нужную кольцевую диафрагму, в результате чего в окуляре помимо фазового темно-серого кольца объектива появится изображение светлого кольца диафрагмы конденсора.
  8. Вращая центрировочные винты, совмещают светлое кольцо конденсора с темным кольцом объектива.
  9. Вспомогательный микроскоп заменяют окуляром.
  10. При исследовании объекта используют желто-зеленый светофильтр, который входит в комплект фазово-контрастного устройства.

При правильной установке освещения изображение объектов в препарате должно получиться очень контрастным. При смене объективов или препарата необходимо проверить совмещенность кольцевой диафрагмы конденсора с фазовым кольцом объектива.

Люминесцентный микроскоп

Фотолюминесценцией называют свечение объектов, возникающее в результате поглощенной ими лучистой энергии. Вследствие некоторых причин свет люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенный (правило Стокса). Поэтому люминесценцию выгодно возбуждать либо ультрафиолетовыми лучами (30-400 нм), либо сине-фиолетовыми. В обоих случаях возникает люминесценция в цветовой гамме всего или большей части видимого спектра, что дает цветное изображение.

Объект, не дающий явления люминесценции, окрашивают специальными красителями — флюорохромами, после чего нефлюоресцирующие компоненты препарата начинают проявлять явления флюоресценции. Из синтетических флюорохромов наилучшие результаты дают акридин оранжевый, корифосфин, примулин, родамин, ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианат), которые обычно применяют в виде слабых водных растворов. Этот вид люминесценции носит название наведенной, вторичной, в отличие от первичной — собственной флюоресценции, нередко проявляемой витаминами, многими пигментами, некоторыми жировыми веществами и антибиотиками, встречающимися в живых организмах, а также некоторыми продуктами нормального и патологического обмена.

Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: цветным изображением, высокой степенью контрастности светящихся объектов на темном поле, возможностью исследования как прозрачных, так и непрозрачных живых объектов, различных жизненных процессов в динамике их развития, а также возможностью обнаружения и установления локализации отдельных микробов и вирусов.

В настоящее время отечественная промышленность выпускает несколько моделей люминесцентных микроскопов, обеспечивающих исследование объектов путем их освещения в проходящем или отраженном свете в стационарных и полевых условиях: ЛЮМАМ Р-8, МЛД-2, МЛП-01, и ряд моделей для специальных исследований (универсальный исследовательский биологический микроскоп МБИ-15-2). Кроме микроскопа с вмонтированным в него осветителем, работающим на ртутно-кварцевой лампе (ДРШ 250-3, ДРШ 100-2 и другие модели) в комплект прибора входят набор объективов, окуляров и светофильтров, электропульт для питания ртутно-кварцевой лампы, а также специальная переходная втулка фототубуса и втулка фотокамер для установки микрофотонасадки (МФН-11 или МФН-12). Светофильтры, имеющиеся в наборе микроскопа, предназначены для выделения из общего излучения источника света строго определенных участков спектра.

В микробиологии применяют два метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител. Метод флуорохромирования почти не отличается от общеизвестных методов окрашивания анилиновыми красителями, хотя и требует меньше времени (доли минуты). В бактериологии этот метод применяется для диагностики таких инфекционных форм, как туберкулез, дифтерия, гонорея, возвратный тиф и др. Кроме перечисленных, отечественная промышленность выпускает микроскопы других типов и приспособления к ним. Из них следует назвать ультрафиолетовый, поляризационный, интерференционный, анаптральный и стерескопический микроскопы. Последнее слово микроскопической техники − биологические микроскопы нового поколения единой системы «ЕС» с широкопольной оптикой повышенного контраста изображения со встроенным осветителем (лампа КГМ-6-20) и блоком питания. Эти микроскопы (ЕС БИМАМ Р-11, ЕС БИМАМ Р-13, ЕС БИМАМ Р-31) оснащены бинокуляром, столом с координатным перемещением и предназначены для наблюдения объектов в проходящем свете в светлом поле.

Электронный микроскоп

Электронная микроскопия делает возможным исследование объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм), и находит применение для изучения вирусов, бактериофагов, тонкого строения клеток микроорганизмов и других субмикроскопических объектов, а также макромолекулярных структур.

Приготовление препаратов для исследования микроорганизмов в электронном микроскопе имеет ряд особенностей (максимальная очистка исследуемого материала от примесей; малая толщина биологического объекта, не более 0,1 мкм; препараты готовят на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницаемо для электронов; для предохранения объекта от разрушения потоком электронов препарат исследуют в течение минимального времени).

Различают прямые и косвенные методы приготовления препаратов. При прямых методах исследуемый материал наносят на ультратонкую пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую сеточку, содержащую до 100 ячеек в 1 мм. Используют органические или неорганические пленки-подложки из коллодия, формвара, углерода, кварца и др. При электронной микроскопии эти пленки не должны обнаруживать собственной структуры и при этом быть достаточно прочными, чтобы выдержать облучение электронами. В биологических исследованиях применяют коллоидные пленки толщиной порядка 10-20 нм.

Широкое распространение получил метод выращивания различных микроорганизмов непосредственно на коллодиевых пленках, находящихся на поверхности питательной среды, и серийного их исследования в электронном микроскопе.

При косвенном методе на объект наносят тонкий слой какого-либо вещества (коллодий, кварц, углерод, разнообразные пластмассы) и делают отпечаток-реплику структуры его поверхности. Приготовленный таким образом препарат изучают в электронном микроскопе.

Повышение контрастности изображения объектов достигается несколькими методами.

Метод оттенения

На исследуемый объект наносят тонкий слой металла (хром, золото, уран и др.). Оттенение препаратов проводят на специальных установках вакуумного распыления. При оттенении тяжелыми металлами удается значительно повысить контрастность изображения и получить представление о третьем его измерении.

Метод позитивного контрастирования

Препарат обрабатывают химическими веществами, которые специфически соединяются с определенными структурами объекта. Так, например, уранил-ацетат обнаруживает нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды, осмий — липоиды; белки выявляются при обработке солями свинца, фосфорно-молиб-деновой и фосфорно-вольфрамовой кислотами. В результате обработки эти структуры становятся менее проницаемыми для электронов и на экране микроскопа выглядят темными на светлом фоне поля.

Метод негативного контрастирования

Контрастное вещество (например, фосфорно-вольфрамовая кислота при нейтральном значении рН) при обработке препарата не проникает внутрь, а покрывает его поверхность снаружи. Создается эффект негативного контраста — на темном фоне фосфорно-вольфрамовой кислоты, которая задерживает электронные лучи, выявляются светлые структуры более проницаемого для электронов биологического объекта.

Наиболее полные сведения о внутренней организации микроорганизмов можно получить, применяя метод ультратонких срезов.

Исследуемый объект фиксируют, затем обезвоживают в спиртах восходящей концентрации и заливают в полимеризующиеся пластмассы (например, метакрилаты). После полимеризации из блоков с помощью специальных ультра-микротомов готовят ультратонкие срезы толщиной 15-30 нм, контрастируют их и исследуют.

Исследование микроорганизмов в окрашенном состоянии

Окрашенные тела микроорганизмов резко отличаются от общего фона препарата, что позволяет установить: а) ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта; б) степень чистоты выделяемой культуры; в) некоторые морфологические особенности микроорганизмов (форму, размеры, наличие спор, жгутиков, капсул).

Приготовление окрашенного препарата состоит из нескольких последовательных операций: подготовки мазка, высушивания, фиксации, окраски. Для этого используют совершенно чистые обезжиренные стекла. Наиболее простой способ обезжиривания состоит в натирании предметного стекла кусочком сухого мыла, а затем протирании чистой марлей. Капля воды, нанесенная на хорошо подготовленную поверхность, легко расплывается.

При взятии бактериальной культуры поступают следующим образом:

  1. нагревают до покраснения бактериологическую петлю в пламени; петлю держат в правой руке за петледержатель;
  2. берут пробирку с культурой в левую руку так, чтобы видеть поверхность питательной среды; вращательным движением вынимают пробку из пробирки, прижимая ее мизинцем и безымянным пальцем правой руки к ладони;
  3. обжигают край пробирки, осторожно вводят петлю и берут материал;
  4. вынимают петлю, обжигают край пробирки, закрывают ее пробкой (рис. 4).

Техника приготовления мазка

Рисунок 4. Техника приготовления мазка

Если препарат готовят из бактериальной культуры, выращенной на плотной питательной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильного физиологического раствора или стерильной водопроводной воды.

Взятый материал осторожно круговыми движениями распределяют по стеклу ровным тонким слоем, после чего петлю немедленно стерилизуют в пламени. Следует помнить, что в этот период происходит работа с живыми микроорганизмами, поэтому резкие движения могут привести к разбрызгиванию материала и повлечь за собой инфицирование рук и окружающих предметов.

Мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в токе теплого воздуха, держа предметное стекло высоко над пламенем. Нельзя допускать перегрева, так как при этом может нарушиться структура микроорганизмов.

При фиксации мазка микроорганизмы погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла, не смываясь при дальнейшей обработке. Наиболее распространенным способом является фиксация в пламени. Предметное стекло (мазком вверх) троекратно проводят через пламя. При таком способе фиксации сохраняются форма бактерий, споры, зерна волютина, однако способ нельзя применять для мазков крови, мазков-отпечатков из органов, а также при выявлении спор и жгутиков. Для этих целей проводят фиксацию в этиловом спирте (20 мин.), в жидкости Никифорова, состоящей из смеси равных объемов этилового спирта и серного эфира (20 мин.), в холодном ацетоне.

Существуют простые и сложные методы окраски. При применении простых методов используется только одна краска — водный фуксин (1-2 мин.) или метиленовый синий (3-5 мин.). По окончании окрашивания препарат промывают струей воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной, и сушат его на воздухе при комнатной температуре или осторожно промокая фильтровальной бумагой.

Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выявить определенные структуры бактериальной клетки.

Окраска по Граму

Окраску необходимо проводить в следующей последовательности.

  1. Окрасить мазок генцианвиолетом (2 мин., через фильтровальную бумагу).
  2. Бумагу удалить, оставшуюся краску слить.
  3. Окрасить мазок раствором Люголя (1 мин.).
  4. Раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% этанола (30-40 с., осторожно покачивать стекло).
  5. Тщательно смыть спирт водой.
  6. Окрасить водным фуксином (2 мин.).
  7. Промыть водой и высушить.

Все бактерии по отношению к окраске по Граму делятся на грамполо-жительные — темно-фиолетового цвета и грамотрицательные — красного (рис.5). Способность окрашиваться в тот или другой цвет зависит от их химического состава. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют аро-матические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. В результате образуется прочный химический комплекс с белком, генцианвиолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных такой комплекс не образуется. Они легко обесцвечиваются под действием спирта.

Успех окраски зависит от ряда причин и прежде всего от правильности обра-ботки спиртом. При длительном его воздействии краска может быть вымыта и из грамположительных бактерий. В таком случае в ходе дополнительной окрас-ки фуксином они примут красный цвет. Слишком кратковременное действие спирта не позволит выявить грамотрицательные бактерии.

Окраска по Граму. Фиолетовые стафилококки и красные вибрионыОкраска по Граму. Фиолетовые стафилококки и красные вибрионы

Рисунок 5. Окраска по Граму. Фиолетовые стафилококки и красные вибрионы

Реактивы для окраски по Граму

  1. Карболовый генцианвиолет
    • генцианвиолета 1 г
    • кислоты карболовой (фенола) 2 г
    • этанола 96% 10 мл
    • воды дистиллированной 100 мл

Растереть в ступке генцианвиолет с карболовой кислотой, добавляя в начале спирт, а потом воду. Раствор выдержать сутки, профильтровать и использовать для окраски.

  1. Раствор Люголя
    • калия йодида 2 г
    • йода кристаллического 1 г
    • воды дистиллированной 300 мл

В небольшом объеме дистиллированной воды растворить йодистый калий, а затем кристаллический йод, после этого довести объем до 300 мл.

  1. Спирт 96%
  2. Водный фуксин Пфейффера

Приготовление красок

Фуксин готовят в виде концентрированного раствора Циля. Раствор обладает большой стойкостью при хранении. Его применяют при сложных методах окраски (окраска спор, кислотоустойчивых бактерий). Для простого окра-шивания используют фуксин Пфейффера (фуксин Циля, разведенный в 10 раз дистиллированной водой). Он нестоек, и готовят его для работы на один день.

Окраска кислотоустойчивых бактерий

Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной устойчивостью к неорганическим кислотам, спиртам и щелочам. Это связано с наличием в кле-точной стенке и цитоплазме сравнительно большого количества липидов (воскоподобных веществ). Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными красками, поэтому применяют концентрированные растворы красок с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой тела микробных клеток, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии от бактерий, не обладающих этим свойством. Их окрашивают по методу Циля − Нильсена, разработанному с уче-том всех указанных особенностей.

Окраску необходимо проводить в следующей последовательности.

  1. Нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 мин.).
  2. Бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 5% серной кислотой.
  3. Тщательно промыть водой.
  4. Окрасить леффлеровской синькой (3-5 мин.).
  5. Промыть водой и высушить.

Кислотоустойчивые бактерии в результате такой окраски становятся рубиново-красными, а остальные − синими.

  1. Карболовый фуксин Циля
    • Фуксина основного 1 г
    • Спирта 96% 10 мл
    • Кислоты карболовой кристаллической 5 г
    • Воды дистиллированной 100 мл

Растереть в ступке фуксин с карболовой кислотой, спирт добавлять постепенно, а затем небольшими порциями влить дистиллированную воду.

  1. Метиленовая синь по Леффлеру
    • Насыщенного спиртового раствора метиленового синего 30 мл
    • Воды дистиллированной 100 мл
    • % водного раствора КОН 1 мл

Окраска спор

Некоторые виды бактерий образуют внутриклеточные (эндогенные) споры. В отличие от вегетативной клетки они обладают меньшим количеством свобод-ной воды, а также высоким содержанием липидов и кальция.

Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за малой проницаемости оболочки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспри-нимается только вегетативной частью микробной клетки, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее оболочки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при использовании концентрированного раст-вора краски с подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработ-ке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немед-ленно отдают краску.

Окраска спор по методу Ожешко

  1. Нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 мин).
  2. Слить кислоту, промыть водой, высушить.
  3. Зафиксировать в пламени.
  4. Окрасить по методу Циля − Нильсена. При этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы − в синий (рис. 6). Часто для окраски спор используют только метод Циля − Нильсена.

Споры возбудителя столбняка, окрашенные в красный цвет

Рисунок 6. Споры возбудителя столбняка, окрашенные в красный цвет

Окраска включений волютина

Волютин — производное нуклеиновой кислоты — играет роль запасного питательного вещества. Среди включений запасного характера − жиры, гликоген, волютин, который занимает особое место. На основании его присутствия и особого расположения в клетке ставят предварительный диагноз методом бактериоскопии при подозрении на дифтерию. Наиболее демонстративные результаты удается получить при окраске зерен волютина по методу Нейссера.

Методика проведения

  1. Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 мин).
  2. Промыть.
  3. Окрасить раствором Люголя (30 с).
  4. Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 мин).
  5. Промыть препарат и высушить.

Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, воспринимает щелочной краситель везувин и приобретает желтый цвет. Зерна волютина, прочно фиксировавшие ацетат цинка, − темно-синие, почти черные.

Реактивы для окраски по методу Нейссера

  1. Уксуснокислая синька Нейссера
    • метиленового синего 0,1 г
    • спирта 96% 2 мл
    • уксусной кислоты конц. 5 мл
    • воды дистиллированной 100 мл
  2. Везувин
    • везувина 2 г
    • воды дистиллированной 300 мл

Прокипятить приготовленный раствор и, охладив, профильтровать.

Обнаружение капсул у бактерий

Некоторые микробы обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки, его называют капсулой. В состав капсул входят, главным образом, полисахариды, но у некоторых они содержат и полипептиды. Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для их обнаружения применяют негативную окраску. Все перечисленные методы относятся к позитивным, так как при их использовании окрашиваются микроб-ные клетки. При негативных способах краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне.

Методика обнаружения капсул по методу Бурри

  1. Смешать на предметном стекле немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши; приготовить тонкий мазок.
  2. Высушить на воздухе и бактериоскопировать. На темном фоне хорошо видны бесцветные капсулы.

Модификация по Бурри − Гинсу включает создание фона индикатором конго красный, последующую фиксацию в 5% растворе НСl и дополнительную окраску водным фуксином. В результате общий фон − темного цвета, капсулы − бесцветные, а тела бактерий − красные.

Окраска по Романовскому — Гимзе

Относится к сложным методам и применяется чаще всего для мазков-отпечатков из органов или мазков крови после фиксации в жидком фиксаторе. Позволяет выявить ядерные элементы бактериальных клеток и гранулы волютина. Для окраски берут каплю готовой краски на 1 мл воды, которая должна быть подщелочена до рН 7,2.

Методика проведения

  1. Поместить препарат (мазком вниз) в чашку Петри, подложив под края стекла спички или кусочки предметных стекол.
  2. Подлить краску сбоку так, чтобы она без пузырей подтекла под мазок (красить 1-24 ч.).
  3. Промыть водой (рН 7,2) и высушить.

Протоплазма молодых клеток окрашивается в сине-фиолетовый цвет, ядерные элементы — в красно-фиолетовый.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

  1. Какие типы микробиологических лабораторий существуют.
  2. Принципы организации микробиологической учебной лаборатории. Оснащение микробиологической лаборатории и рабочего места. Правила работы и техника безопасности.
  3. Устройство светового микроскопа. Иммерсионная микроскопия.
  4. Темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная и электронная микроскопия и микроскопы (устройства).
  5. Приготовление фиксированных препаратов мазков.
  6. Простые и сложные методы окраски. Механизм и этапы окраски по Граму. Особенности окраски методами Романовского, Ожешко, Бурри − Гинса, Нейссера, Циля − Нильсена.
  7. Приготовление препаратов для изучения микроорганизмов в нативном состоянии. Методы «висячей», «раздавленной» капли. Витальная (прижизненная) окраска.

РАБОТА ПОД РУКОВОДСТВОМ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ

  1. Ознакомление с основными приборами и оборудованием, используемыми в микробиологических лабораториях.
  2. Изучение иммерсионной системы светового микроскопа.
  3. Приготовление фиксированных мазков из бактериальных культур и их окраска простыми методами.
  4. Микроскопия окрашенных препаратов с использованием обычных и иммерсионных систем.
  5. Приготовление фиксированных мазков из бактериальных культур и их окраска сложными методами (по Граму, Цилю — Нильсену, Ожешко, Нейссеру, Бурри — Гинсу).
  6. Приготовление препаратов для изучения бактерий в живом состоянии.
  7. Приготовление мазков «висячей» и «раздавленной» капли.
  8. Приготовление препаратов, окрашенных метиленовым синим.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

  1. Записать основные правила работы в микробиологической лаборатории.
  2. Приготовить нативные мазки «висячей» и «раздавленной » капли.
  3. Приготовить фиксированные препараты из смеси бактериальных культур.
  4. Провести микроскопию и зарисовать микроскопические препараты.

ТЕМА № 2. Морфология бактерий. Ультраструктура бактериальной клетки

Знание морфологии и изучение ультраструктуры бактерий является основой микроскопического метода исследования и необходимо для правильного применения химиотерапевтических препаратов.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Изучение морфологии и ультраструктуры бактерий.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Формы бактериальных клеток и методы изучения морфологических особенностей.
  2. Основные морфологические особенности бактерий.
  3. Основные морфологические типы бактерий.
  4. Элементы ультраструктуры бактериальной клетки.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Дифференцировать бактерии по морфологическим признакам.
  2. Определить родовую принадлежность конкретных бактерий по морфологическим признакам.

Морфология бактерий

По форме клеток бактерии делятся на шаровидные, палочковидные и извитые. Шаровидные бактерии (кокки) имеют сферическую форму и по взаимному расположению клеток после деления различаются:

  • микрококки- клетки расходятся и располагаются одиночно;
  • диплококки- клетки располагаются попарно;
  • стрептококки-кокки делятся в одной плоскости и не расходятся после деления;
  • тетракокки-деление клеток происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях и клетки располагаются по четыре;
  • сарцины (пакеты)- деление происходит в трёх взаимно перпендикулярных плоскостях;
  • скопления кокков, внешне напоминающие виноградную гроздь, называются стафилококками.

Кокки имеют диаметр 1-2 мкм.

Палочковидные бактерии различаются формой клеток, размерами и расположением. Длина их в зависимости от вида микроорганизма колеблется от 0,5 до 8 мкм, а поперечник — от 0,3 до 2 мкм.

Палочки могут быть правильной и неправильной формы, в том числе ветвящиеся, например, у актиномицетов.
По характеру расположения клеток в мазках выделяют:

  • монобактерии — расположены отдельными клетками;
  • диплобактерии — расположены по две клетки;
  • стрептобактериии — после деления образуют цепочки клеток.

Палочковидные бактерии могут образовывать споры: бациллы и клостридии.

Извитые формы бактерий представлены изогнутыми палочками и могут иметь один или несколько витков спирали. Слегка изогнутые палочки называются вибрионами. Они имеют длину 1-3 мкм.

Спириллы- длинные, изогнутые (один или несколько завитков).

Спирохеты длинные, тонкие клетки с большим количеством мелких завитков.

Структура бактериальной клетки

Клетка — универсальная структурная единица живой материи. Организация бактериальной клетки обеспечивает удвоение биомассы за определенный срок за счет размножения посредством бинарного деления.

Элементы ультраструктуры бактериальной клетки

В составе прокариотической клетки выделяют следующие структуры.

  1. Клеточная стенка; по химической структуре клеточной стенки различают грамположительные и грамотрицательные бактерии.
  2. Периплазматическое пространство.
  3. Цитоплазматическая мембрана.
  4. Цитоплазма, нуклеоид, мезосомы (аналог митохондрий у эукариотов), рибосомы, включения;
  5. У некоторых бактерий — капсула, микрокапсула, жгутики, плазмиды, фимбрии (реснички), споры.

Клеточная стенка — важный и обязательный структурный элемент подавляющего большинства прокариотных клеток. На долю клеточной стенки приходится от 5 до 50% сухих веществ клетки. Клеточная стенка служит механическим барьером между протопластом и внешней средой и придает клеткам определенную, присущую им форму.

Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет однородную струк-туру, ковалентно связана с ригидным слоем, содержит небольшие количества липидов, полисахаридов и белков. Она значительно толще, чем у грамотри-цательных бактерий, и достигает 20-60 нм. Основную массу стенки составляют 5-6 слов пептидогликана, с которым ковалентно связаны тейхоевые кислоты. Особенностью пептидогликанов грамположительных бактерий является от-сутствие диаминопимелиновой кислоты.

Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-18 нм. Ригидный слой представлен 1-2 слоями пептидогликана, в котором есть диаминопимелиновая кислота. В составе клеточной стенки содержится много лиопротеинов, фосфолипидов, липополисахаридов, больше белка, но отсутст-вуют тейхоевые кислоты. Пластичный слой клеточной стенки представлен сложной мозаикой из липопротеинов, липополисахаридов и наружной мембра-ны.

Некоторые бактерии имеют пространство (зону) между клеточной стенкой и плазматической мембраной — периплазматическое пространство (периплазма). Толщина периплазмы составляет около 10 нм и может включать до 20% всей находящейся в клетке воды. В ней локализуются некоторые ферменты и транспортные белки — переносчики соответствующих субстратов.

К клеточной оболочке бактериальной клетки тесно прилегает внешний слой цитоплазмы — цитоплазматическая мембрана. Она состоит из двух слоев липидов и встроенных в липидную мембрану белковых молекул. Компоненты цитоплазматической мембраны ( ЦПМ ) составляют около 10% сухого веса бактериальной клетки. Эта полупроницаемая мембрана контролирует транспорт питательных веществ и воды в клетку, а также является физическим барьером между внутренним содержимым бактериальной клетки и внешней средой.

Содержимое тела бактериальной клетки, или ее цитоплазма, представляет собой желеобразный, вязкий раствор, в котором растворены различные органические и неорганические соединения. Бактериальная цитоплазма неподвижна, имеет высокую плотность, содержит мелкие зерна, состоящие из 60% РНК и 40% протеина, представляющие собой рибонуклеопротеиды, получившие название «рибосом». Они выполняют функцию синтеза белка. Цитоплазма большинства бактерий содержит ДНК и запасные гранулы (крахмала, гликогена, жировых веществ), пигментные скопления, сера, кальций.

Нуклеоид, ядерное вещество клетки, ее наследственный аппарат, состоит из двойной нити ДНК, сомкнутой в кольцо и свободно погруженное в цитоплазму, в отличие от эукариот. В молекуле ДНК закодирована генетическая информация клетки.

Мембранные структуры прокариот менее дифференцированы, чем органоиды эукариот. Бактерии имеют лишь аналоги некоторые из них. Например, аналогом митохондрий у прокариот являются мезосомы, которые образуются путём инвагинации цитоплазматической мембраны и содержат ферменты, необходимые для синтеза АТФ.

У бактерий различают микрокапсулу, капсулу и слизистый слой, которые относятся к факторам патогенности. Микрокапсулы выявляются на электрон-ных микрофотографиях в виде коротких мукополисахаридных фибрилл. Капсула (слизистый слой) играет роль внешнего покрова бактерии, защищает от неблагоприятного воздействия факторов внешней среды и обнаруживается под световым микроскопом после окрашивания по методу Бурри − Гинса.

У некоторых видов микробов имеются пили (реснички, фимбрии, филаменты), представляющие собой образования, которые значительно короче и тоньше жгутиков. Они покрывают тело клетки. Полагают, что они не являются органами передвижения, а способствуют прикреплению микробных клеток к поверхности некоторых субстратов.

Жгутики предназначены для передвижения бактерий. Жгутики построены из специального белка –флагелина. Длина его составляет 20 мкм, диаметр 10-20 нм.

По расположению жгутиков подвижные микробы подразделяются на 4 группы (рис. 7):

  • монотрихи — бактерии с одним жгутиком на конце (холерный вибрион);
  • амфитрихи — бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;
  • лофотрихи — бактерии, которые имеют по пучку жгутиков на одном конце (палочки сине-зеленого молока);
  • перитрихи — бактерии, обладающие жгутиками по всей поверхности тела (кишечная палочка).

Жгутикование бактерий

Рисунок 7. Жгутикование бактерий: A — монотрихиальное, B — лофотрихиальное, C — амфитрихиальное,
D — перитрихиальное.

Исследование микроорганизмов в живом состоянии

В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их фор-мы, подвижности или определения прижизненной внутренней структуры. Изучают нативные и окрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли.

Прижизненная (витальная) окраска

Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового си-него или нейтрального красного. Затем готовят препарат «раздавленная» или «висячая» капля и микроскопируют.

Приготовление препарата «раздавленная капля»

На центр обезжиренного предметного стекла наносят каплю жидкой бульонной культуры. Если культура выращивалась на плотной питательной среде, то на стекло наносят каплю стерильного изотонического раствора натрия хлорида, затем петлей прикасаются к культуре и приставшие к ней бактерии размешивают в приготовленной капле. Можно заранее приготовить взвесь микроорганизмов в изотоническом растворе и взять каплю из нее. На исследуемый материал накладывают покровное стекло так, чтобы не было пузырьков воздуха. Каплю надо брать такой величины, чтобы она заполняла все простран-ство между покровным и предметным стеклами и не выступала за края по-кровного. Препарат можно рассматривать как с сухими системами, так и с иммерсионной. Микроскопируют, используя объективы 40х или 90х. Очень хорошие результаты получают, применяя темнопольное или фазово-контрастное устройства. Препараты быстро высыхают, поэтому, если их приходится рассматривать не тотчас, а спустя некоторое время, их помещают во влажную камеру (чашку Петри), на дно которой положено 2-3 влажных кружка фильтро-вальной бумаги, покрытых двумя сухими.

Во избежание высыхания препарата и вызываемого конвекцией турбулент-ного движения жидкости подобные препараты можно герметизировать. Для этой цели следует пользоваться парафиновым маслом, смесью равных частей парафина и вазелина или лаком для ногтей.

В центре влажного препарата быстро возникает недостаточность кислорода. В сущности именно это помогло Пастеру открыть анаэробный обмен: наблюдая за препаратом, он заметил, что облигатные анаэробы сохраняли подвижность только в центре, но не по краям.

Подвижные микроорганизмы иногда могут адсорбироваться на стекле; в та-ких случаях подвижность легче наблюдать в «висячей» капле.

Приготовление препарата «висячая капля»

Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной взвеси. Затем предметное стекло с лункой, края которой пред-варительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки, в результате чего стекла склеиваются. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает. В правильно приготовленном препарате капля свободно висит над лункой, не касаясь ее дна или края (рис.8). Микроскопируют со стороны покровного стекла, причём вначале следует найти край на малом увеличении и при суженной диафраг-ме, используя сухой объектив 8х, затем на большом и продолжить наблюдение.

Схема приготовления разведений и рассева суспензии микроорганизмов шпателем

Рисунок 16. Схема приготовления разведений и рассева суспензии микроорганизмов шпателем

Агаризованную среду можно подсушить, поместив чашки в термостат на 2—3 суток крышками вниз. После того как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2—4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1, 0,5 или 1 мл) суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 48—50° агаризованную среду, тщательно перемешивают и затем немедленно выливают в чашку Петри. Среде дают застыть. В случае глубинного посева обычно пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующим образом: по

1 мл из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2—4 стерильные чашки Петри. Затем заливают чашки 15—20 мл расплавленной и остуженной до 48—50° плотной средой и тщательно смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. Когда среда застынет чашки Петри помещают в термостат.

Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри с плотной средой после посева помещают в анаэростаты.

Подсчет выросших колоний

Колонии бактерий подсчитывают обычно через 3, колонии грибов и дрожжей — через 5—7, а колонии актиномицетов — через 7—15 суток инкубации в термостате.

Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства чернилами или карандашом по стеклу отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, подсчитывают число колоний в каждом секторе и результаты суммируют. Существуют специальные счётчики для подсчёта колоний (рис.17). Для подсчёта колоний чашкуПетри крышкой вниз помещают на стерильный столик (1), подсвечиваемый снизу, и подсчитывают колонии пером с пружинным острием (2). Остриём пера касаются дна чашки в участке, соответствующем положению колоний, и нажимают на перо. В результате на стекле остается метка, а держатель поднимается вверх, замыкая цепь, и показания счётчика увеличиваются на единицу. Затем острие пера поднимают над стеклом, пружина возвращает его в исходное положение, и цепь размыкается.

Счетчик для подсчета числа колоний микроорганизмов

Рисунок 17. Счетчик для подсчета числа колоний микроорганизмов

Лучшим разведением следует считать то, при высеве из которого на агаровой пластинке в чашке Петри вырастает от 30—50 до 100— 150 колоний. Если число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из данного разведения на одной чашке.

Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:

M=\frac{a\cdot 10^n}{V}, [6.3]

где

  • М - количество клеток в 1 мл,
  • а - среднее число колоний при высеве данного разведения,
  • 10 — коэффициент разведения,
  • n - порядковый номер разведения, из которого сделан высев,
  • V - объем суспензии, взятый для посева, в мл.

Метод посева в агаризованную среду осуществляют путем внесения в стерильную чашку Петри суспензии микроорганизмов из соответствующего разведения с последующим заливанием расплавленной и охлажденной до 450 агаризованной средой. Содержимое чашки перемешивают и дают среде застыть.

Метод посева в тонком слое предполагает внесение разведенной суспензии микроорганизмов в пробирки с небольшим объемом (2,5 –3,5 мл) расплавленной полужидкой агаризованной средой, которую затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшей агаризованной среды и дают застыть верхнему слою.

Каждый из вышеперечисленных методов посева имеет свою область использования и определенные ограничения. При посеве на поверхность агаризованной среды все выросшие колонии являются поверхностными. Именно в этом случае изучают характерные изменения в индикаторных агаровых средах. При посеве в агаризованные среды колонии, как правило, компактны и невелики по размерам, так как формируются под слоем агара, что дает возможность учета большего их количества. Вторым преимуществом метода является возможность дополнительных манипуляций с составом среды: верхний и нижний слой могут содержать разные питательные добавки. Кроме того, к верхнему слою могут быть добавлены красители для облегчения обнаружения колоний.

Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)

Метод нашел широкое применение для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не развиваются на плотных питательных средах. Этим же методом пользуются при определении численности бактерий, относящихся к той или иной физиологической группе. Сущность метода предельных разве-дений состоит в следующем. В пробирки с жидкой средой вносят строго из-меренный объём из различных разведений исследуемого субстрата (рис.18). После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался или от-сутствовал рост, рассчитывают по таблицам наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл исходного субстрата. Необходимо отметить, что опреде-ление численности клеток чашечным методом обеспечивает большую точность по сравнению с методом предельных разведений.

Схема проготовления разведения и посев суспензии микроорганизмов в жидкую среду

Рисунок 18. Схема проготовления разведения и посев суспензии микроорганизмов в жидкую среду

Определение количества микроорганизмов методом предельных разведений включает приготовление разведений, посев в жидкую среду, регистрацию на-личия или отсутствия роста после инкубации и расчет наиболее вероятного числа клеток в единице объема исходного субстрата.

Приготовление разведений

Разведения исходной суспензии готовят точно так же, как и для чашечного метода.

Посев в среду и регистрация результатов

Питательную среду, благоприятную для развития микроорганизмов, численность которых хотят определить, предварительно разливают в пробирки (колбы) и стерилизуют. В пробирки (колбы) следует наливать одинаковый объем среды. Посев проводят из каждого разведения или из четырех-пяти последних, причем каждое разведение высе-вают в 3—5 параллельных пробирок. Количество посевного материала везде одинаково и, как правило, составляет 1 мл. Засеянные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблется от 3 до 10 суток и зависит от скорости роста микроорганизмов, численность которых определяют. После инкубации регистрируют рост микроорганизмов, используя различные показатели: помут-нение среды, образование пленки, осадка, газа или накопление в среде опреде-ленных продуктов метаболизма.

Наиболее вероятное количество клеток в единице объема рассчитывают по таблице Мак-Креди (табл. 4), разработанной на основании методов вариаци-онной статистики. Для этого первоначально составляют числовую характерис-тику, которая включает три цифры. Первая цифра слева показывает число про-бирок в том последнем разведении, при высеве из которого во всех засеянных пробирках был отмечен рост. Две следующие цифры обозначают число проби-рок, в которых отмечен рост микроорганизмов при засеве их из двух последу-ющих разведений. Затем по таблице находят наиболее вероятное число микро-организмов, соответствующее данному значению числовой характеристики. Количество микроорганизмов в 1 мл (1 г) исходного субстрата соответствует этому числу, умноженному на то разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.

Пример 1

Разведение исходной суспензии 0 10-1 10-2 10-3 10-4
Число засеянных пробирок 4 4 4 4 4
Число пробирок, в которых обнаружен рост 4 4 3 1 0
Числовая характеристика 431 - - - -
Наиболее вероятное число клеток микроорганизмов 16,5 - - - -
Количество клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии 165 - - - -

Пример 2

Разведение исходной суспензии 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Число засеянных пробирок 3 3 3 3 3
Число пробирок, в которых обнаружен рост 3 3 2 0 0
Числовая характеристика 320 - - - -
Наиболее вероятное число клеток микроорганизмов 9,5 - - - -
Количество клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии 9,5 103 - - -

Таблица 4. Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объёма исходной суспензии (по Мак-Креди)

Числовая характеристика

Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок в числе

Числовая характеристика

Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок в числе

Числовая характеристика

Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок в числе

2

3

4

5

2

3

4

5

2

3

4

5

000

0,0

0,0

0,0

0,0

222

110

3,5

2,0

1,4

433

-

-

30,0

-

001

-

0,5

0,5

0,2

223

-

4,0

-

-

434

-

-

35,0

-

002

-

-

0,5

0,4

230

-

3,0

1,7

1,2

440

-

-

25,0

3,5

003

-

-

0,7

-

231

-

3,5

2,0

1,4

441

-

-

40,0

4,0

010

0,5

0,3

0,2

0,2

232

-

4,0

-

-

442

-

-

70,0

-

011

0,9

0,6

0,5

0,4

240

-

-

2,0

1,4

443

-

-

140,0

-

012

-

-

0,7

0,6

241

-

-

3,0

-

444

-

-

160,0

-

013

-

-

0,9

-

300

-

2,5

1,1

0,8

450

-

-

-

5,0

020

0,9

0,6

0,5

0,4

301

-

4,0

1,6

1,1

451

-

-

-

4,0

021

-

-

0,7

0,6

302

-

6,5

2,0

1,4

500

-

-

-

2,5

022

-

-

0,9

-

303

-

-

2,5

-

501

-

-

-

3,0

030

-

-

0,7

0,6

310

-

4,5

1,6

1,1

502

-

-

-

4,0

031

-

-

0,9

-

311

-

7,5

2,0

1,4

503

-

-

-

6,0

040

-

-

0,9

-

312

-

11,5

3,0

1,7

504

-

-

-

7,5

041

-

-

1,2

-

313

-

16,5

3,5

2,0

510

-

-

-

3,5

100

0,6

0,4

0,3

0,2

320

-

9,5

2,0

1,4

511

-

-

-

4,5

101

1,2

0,7

0,5

0,4

321

-

15,0

3,0

1,7

512

-

-

-

6,0

102

-

1,1

0,8

0,6

322

-

20,0

3,5

2,0

513

-

-

-

8,5

103

-

-

1,0

0,8

323

-

30,0

-

-

520

-

-

-

5,0

110

1,3

0,7

0,5

0,4

330

-

25,0

3,0

1,7

521

-

-

-

7,0

111

2,0

1,1

0,8

0,8

331

-

45,0

3,5

2,0

522

-

-

-

9,5

112

-

-

1,1

0,8

332

-

110,0

4,0

-

523

-

-

-

12,0

113

-

-

1,3

-

333

-

140,0

5,0

-

525

-

-

-

15,0

120

2,0

1,1

0,8

0,6

340

-

-

3,5

2,0

524

-

-

-

17,5

121

3,0

1,5

1,1

0,8

341

-

-

4,5

2,5

530

-

-

-

8,0

122

-

-

1,3

1,0

350

-

-

-

2,5

531

-

-

-

11,0

123

-

-

1,6

-

400

-

-

2,5

1,3

532

-

-

-

14,0

130

-

1,6

1,1

0,8

401

-

-

3,5

1,7

533

-

-

-

17,5

131

-

-

1,4

1,0

402

-

-

5,0

2,0

534

-

-

-

20,0

132

-

-

1,6

-

403

-

-

7,0

2,5

535

-

-

-

25,0

140

-

-

1,4

1,1

410

-

-

3,5

1,7

540

-

-

-

13,0

141

-

-

1,7

-

411

-

-

5,5

2,0

541

-

-

-

17,0

200

2,5

0,9

0,6

0,5

412

-

-

8,0

2,5

542

-

-

-

25,0

201

5,0

1,4

0,9

0,7

413

-

-

11,0

-

543

-

-

-

30,0

202

-

2,0

1,2

0,9

414

-

-

14,0

-

544

-

-

-

35,0

203

-

-

1,6

1,2

420

-

-

6,0

2,0

545

-

-

-

45,0

210

6,0

1,5

0,9

0,7

421

-

-

9,5

2,5

550

-

-

-

25,0

211

13,0

2,0

1,3

0,9

423

-

-

17,0

-

551

-

-

-

35,0

212

20,0

3,0

1,6

1,2

422

-

-

13,0

3,0

552

-

-

-

60,0

213

-

-

2,0

-

424

-

-

20,0

-

553

-

-

-

90,0

220

25,0

2,0

1,3

0,9

430

-

-

11,5

1,5

554

-

-

-

100,0

221

70,0

3,0

1,6

1,2

431

-

-

16,5

3,0

555

-

-

-

180,0

432

-

-

20,0

4,0

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

  1. Провести посев суспензии бактерий на агаризованную питательную среду для определения количества жизнеспособных клеток методом Коха.
  2. Определить количество дрожжевых клеток в 1 г прессованных хлебопекарных дрожжей с помощью камеры Горяева

ТЕМА № 7. Возбудители бактериальных кишечных инфекций

Знание биологических особенностей возбудителей ОКИ, брюшного тифа, паратифов важно для понимания технологом и товароведом необходимости соблюдения санитарно-гигиенических требований, обеспечивающих исклю-чение инфицирование пищевых продуктов микроорганизмами-возбудителями пищевых отравлений.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Освоение микробиологической диагностики эшерихиозов, дизентерии, сальмонеллезов, брюшного тифа, паратифов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Морфологические, физиологические и экологические особенности эшерихий, шигелл, сальмонелл.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Приготовить препарат для микроскопирования кишечной палочки.
  2. Описать рост кишечной палочки на средах Эндо и Левина.

Эшерихии

Термином эшерихиозы обозначают группу инфекционных заболеваний, вы-зываемых микроорганизмами рода Escherichia. Более чем в 99 % случаев воз-будителем эшерихиозов является Escherichia coli (около 1 % инфекций этой группы вызывают Escherichia ferqusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vul-neris). Кишечные инфекции, занимающие ведущее положение в структуре эше-рихиозов, связаны с четырьмя различными группами E.coli: энтеротоксиген-ными (ЭТКП), энтероинвазивными (ЭИКП), энтеропатогенными (ЭПКП) и энтрогеморрагическими (ЭГКП) кишечными палочками. Штаммы этих групп различаются, прежде всего, по факторам патогенности, а также по клиническим проявлениям заболеваний, возбудителями которых они являются.

Энтеротоксигенные штаммы E.coli вызывают диарею с выраженным болевым синдромом за счет воздействия на ганглиозидные рецепторы энтероцитов про-дуцируемых микроорганизмами термолабильного и термостабильного энтеро-токсинов, что приводит к активизации аденилатциклазной системы, внутрикле-точному накоплению циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и, как след-ствие, секреции жидкости и электролитов в просвет кишечника.

Энтероинвазивные E.coli, имеющие значительное сходство с микроорганиз-мами рода Shigella по биохимическим и антигенным свойствам, а также прояв-лению вирулентности, способствуют развитию заболеваний, протекающих по типу острой дизентерии.

Энтеропатогенные эшерихии, группируемые в два класса на основе харак-тера взаимодействия с клеточными культурами Hep-2 и Hela, колонизируют эпителий слизистой оболочки тонкой кишки, вызывая возникновение эрозий на его поверхности. Наличие у микроорганизмов плазмидокодируемого О-поли-сахарида с молекулярной массой 54 мДа способствует антифагоцитарной устой-чивости возбудителей и развитию бактериемии.

В настоящее время в качестве самостоятельной группы выделяют так назы-ваемые энтероадгезивные или аутоагглютинирующиеся штаммы E.coli, однако их роль в развитии инфекций ЖКТ выяснена не до конца.

Лабораторная диагностика кишечных инфекций, вызванных E.coli, заключа-ется в выделении чистых культур возбудителя. В качестве образцов для иссле-дования используют фекалии, рвотные массы, мочу, гной, кровь, спинномозго-вую жидкость. При необходимости исследованию подвергают промывные воды, остатки пищи, смывы с рук персонала.

Колонии эшерихий имеют на среде Эндо круглую форму, ровный край, матовую поверхность и малиново-красный цвет без металлического блеска, за-висящий от способности культур расщеплять лактозу (рис. 19). На среде Левина колонии E.coli имеют темно-синий цвет.

Культура бактерии E.coli на среде Эндо

Рисунок 19. Культура бактерии E.coli на среде Эндо

Шигеллы

Термином бактериальная дизентерия (шигеллез) обозначают инфекционное заболевание с поражением, главным образом, толстого кишечника, вызываемое микроорганизмами рода Shigella. Этот термин был предложен Гиппократом для обозначения кровавого поноса. Это короткие (1-3 мкм) грамотрицательные палочки без спор и капсул. К настоящему времени известно 4 вида шигелл: S.dysenteriae, S.flexneri, S.boydii, S.sonnei. Заболевание контагиозно, что приво-дит к эпидемическим вспышкам. Особенно опасно появление больных дизен-терией в организованных коллективах. Шигеллы способны размножаться и накапливаться в пищевых продуктах, особенно молоке. Сохраняются во внешней среде относительно недолго. На овощах и фруктах- до 2 недель, в воде и почве — до 3 месяцев.

Сальмонеллы

Сальмонеллы — короткие грамотрицательные палочки с закругленными кон-цами, длиной 1,5-4 мкм. В большинстве случаев подвижные (перитрихи), спор и капсул не имеют. Род сальмонелл включает виды: S.enterica с семью основными подвидами и S.bongori, которые различаются по ряду биохимических призна-ков. Сальмонеллы устойчивы к низким температурам, к высушиванию, спо-собны длительно сохраняться в пищевых продуктах и окружающей среде. Возбудители брюшного тифа и паратифов — S.typhi, S.paratyphi A, S.paratyphi B, грамотрицательные палочки размером 1-3,5х0,5-0,8 мкм, перитрихи. Рост на бульоне сопровождается помутнением, на МПА образуются нежные круглые, гладкие полупрозрачные колонии диаметром 2-4 мм. На среде Эндо все коло-нии бесцветны (рис. 20), на висмут-сульфит-агаре — черные. Избирательная среда — желчный бульон.

Заболевание распространено повсеместно, ежегодно в мире регистрируется несколько миллионов случаев брюшного тифа.

Рост сальмонелл на среде Эндо

Рисунок 20. Рост сальмонелл на среде Эндо

ТЕМА № 8. Основы санитарной микробиологии

Будущему товароведу и технологу необходимо знание основ санитарной микробиологии.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Ознакомление студентов с основными методами санитарно-микробиологи-ческих исследований.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Основные понятия и термины санитарной микробиологии.
  2. Методы санитарно-микробиологических исследований объектов внешней среды.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Осуществлять отбор проб воды, воздуха, продуктов питания для после-дующего санитарно-бактериологического исследования.

Основные понятия и термины санитарной микробиологии

Объектами санитарно-микробиологического исследования являются вода, воздух, почва и другие объекты окружающей среды, а также пищевые продукты, оборудование пищеблоков и т.п.

По видовому составу биологические загрязнения подразделяется на:

  • загрязнения патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, цианобактериями и микроорганизмами, предназначенными для борьбы с насекомыми, микроорганизмами–продуцентами токсических веществ;
  • загрязнения биологическими веществами: антибиотиками, белками, ферментами, витаминами.

Наиболее существенными с точки зрения размера наносимого ущерба являются следующие биологические загрязнители:

  • хозяйственно-бытовые и сточные воды;
  • отходы животноводческих комплексов;
  • отходы промышленных предприятий по производству
  • антибиотиков, вакцин, сывороток, белков, витаминов,
  • ферментов и т.п.
  • массовое развитие в воде открытых водоемов сине-зеленых водорослей;

Для каждого вида загрязнения должны быть определены предельные допустимые концентрации (ПДК), т.е. такие, которые не влияют отрицательно на процессы самоочищения внешней среды, не подавляют санитарно-показательные микроорганизмы, не усиливают их патогенные свойства, не удлиняют сроки выживания микроорганизмов и не способствуют ухудшению здоровья людей.

Санитарная микробиология располагает двумя методами, с помощью которых можно определить санитарно-эпидемиологическое состояние внешней среды — прямое обнаружения патогенных микроорганизмов во внешней среде и косвенная индикация возможного их присутствия во внешней среде.

Первый метод является более надежным, но трудоемким и недостаточно чувствительным. Второй метод (косвенной индикации) более прост и доступен. Этот метод располагает двумя показателями — критериями, которые позволяют определить санитарно-эпидемиологическую ситуацию. К ним относят общее микробное число и концентрацию санитарно-показательных микроорганизмов.

Общее микробное число (ОМЧ) — это число всех микроорганизмов в 1 миллилитре — мл (см3) или в 1 грамме — (г) субстрата. При этом исходят из предположения, что чем больше микроорганизмов обнаруживается во внешней среде, тем вероятнее загрязнение внешней среды патогенными микроорганизмами.

ОМЧ определяют при контроле очистки воды, в том числе колодезной, проверке эффективности мойки посуды, воздуха в кондитерских цехах и т.п, определении показателя свежести скоропортящихся продуктов, исследовании почвы, при выборе места для строительства объектов питания. ОМЧ используют для определения характера микрофлоры. Если в пищевом продукте, прошедшем термическую обработку, обнаруживаются вегетативные формы микроорганизмов, то это свидетельствует о повторном заражении продукта после термической обработки или об ее неэффективности. Обнаружение спор подтверждает удовлетвортельную термическую обработку.

Термин санитарно-показательные микроорганизмы (СПМО) обозначает такие микроорганизмы, которые постоянно обитают в естественных полостях тела человека (животных) и постоянно выделяются во внешнюю среду.

Чем выше концентрация СПМО, тем больше вероятность присутствия патогенных микроорганизмов. Количество СПМО выражают в титрах и индексах.

Титр — это минимальное количество субстрата (в мл или г), в котором еще обнаруживаются СПМО.

Индекс — это количество СПМО, которое содержится в 1 л воды или в 1 мл другого субстрата.

Наиболее вероятное число (НВЧ) означает количество СПМО в 1 л для воды или в одном г (мл) для другого субстрата. Это более точный показатель, т.к. он имеет доверительные границы, в пределах которых может колебаться с вероятностью 95%.

Общая характеристика санитарно-показательных микроорганизмов

В качестве СПМО предложено довольно много микроорганизмов, их можно условно разделить на три группы:

  • Индикаторы фекального загрязнения (обитатели кишечника человека и животных);
  • Индикаторы воздушно-капельного загрязнения (обитатели верхних дыхательных путей);
  • Индикаторы процессов самоочищения (обитатели внешней среды).

Первая группа санитарно-показательных микроорганизмов

В действующих нормативно-технических документах по контролю за санитарно-бактериологическими показателями воды, пищевых продуктов, почвы предусмотрен учет БГКП.

БГКП — это грамотрицательные, не образующие спор, короткие палочки, сбраживающие глюкозу и лактозу с образованием кислоты и газа при 37°±0,5°С в течение 24–48 ч, не обладающие оксидазной активностью.

В настоящее время узаконена энтерококкометрия для молока, котлет с целью выяснения эффективности их термической обработки.

Протей

В настоящее время показано, что протей встречается в 98% случаев в выделениях кишечника человека и животных.

Обнаружение протея в воде и продуктах указывает на загрязнение объектов разлагающимися субстратами и свидетельствует о крайнем санитарном неблагополучии. При обнаружении протея в пищевых продуктах их бракуют, а воду не разрешают употреблять для питья.

Клостридиум перфрингенс

Клостридиум перфрингенс длительно сохраняется во внешней среде за счет спорообразования, поэтому обнаружение его не свидетельствует о свежем фекальном загрязнении. На эти бактерии губительно действует сопутствующая микрофлора, но их споры устойчивы к концентрациям активного хлора 1,2–1,7 мг/л воды. Такие дозы губительно действуют на энтеровирусы, поэтому клостридиум перфрингенс может служить косвенным показателем наличия в воде энтеровирусов.

Термофилы

Это целая группа СПМО, в основном споровых, растущих при температуре 55–60°С. Обитают во внешней среде и являются показателем загрязнения навозом и компостом. В России их определяют при исследовании почвы, а также в консервах, как индикатор термической обработки, особенно при хранении их в условиях жаркого климата.

Бактериофаги

В качестве СПМО используют бактериофаги кишечной палочки — колифаги, фаги сальмонелл и шигелл. Они обнаруживаются там, где есть соответствующие бактерии, к которым эти фаги адаптированы. Фаги выжи-вают во внешней среде более 9 месяцев.

Они ценны как показатель фекального загрязнения, особенно энтеровирусами, т.к. фаги выделяются из сточных вод с той же частотой, что и энтеровирусы.

Вторая группа санитарно-показательных микроорганизмов

Представители этой группы СПМО определяются в воздухе, в молочных продуктах, в воде. К ним относится a–зеленящий стрептококк (стрептококкус саливариус). Другим санитарно-показательным стрептококком является b–гемолитический стрептококк, он обнаруживается в 80% у людей и, в основном, страдающих воспалительными заболеваниями верхних дыхательных путей. Он обладает гемолитическими свойствами.

Показателем санитарного неблагополучия является и золотистый стафилококк.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы

Почва является важнейшей средой и природным резервуаром обитания микроорганизмов. Вместе с растениями и животными составляют сложные и многообразные биогеоценозы, состав, плотность, функциональная активность и прочие характеристики которых зависят от типа и структуры почвы, состава минеральных и органических веществ, физико-химического состояния, температуры, рН, влажности, концентрации углекислого газа, других факторов. В слое пахотной почвы толщиной 15 см на площади в 1 га может содержаться от 1 до 5-6 тонн микробной массы. Она максимальна на глубине 10-20 см. На глубине свыше 1-2 м микроорганизмы уже встречаются в незначительном количестве; начиная с глубины 5-6 м почва может быть стерильной.

Патогенные микроорганизмы чаще всего попадают в землю с испражнениями, мочой, гноем, мокротой, слюной и другими выделениями, через трупы людей и животных, погибших от инфекционных заболеваний. Патогенные и условно-патогенные микробы контаминируют почву при сбросе фекально-бытовых и сточных вод различных предприятий.

Сроки переживания патогенных для человека микробов в почве широко варьируют. Неспорообразующие бактерии — возбудители дизентерии, брюшного тифа, холеры, чумы, бруцеллеза, туляремии, туберкулеза — выживают в почве от нескольких дней до нескольких месяцев. Споры возбудителей столбняка, сибирской язвы, газовой гангрены могут сохраняться много лет. Более того, для спорообразующих бактерий рода Clostridium почва является естественной средой обитания.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы проводят с целью предупредительного санитарного надзора, текущего санитарного надзора и по эпидемическим показаниям. При проведении текущего санитарного надзора ограничиваются установлением факта и оценкой степени фекального загрязнения почвы. Почвы с преобладанием бактерий, свидетельствующих о фекальном загрязнении, рассматривают как санитарно неблагополучные. Для определения давности фекального загрязнения почвы определяют несколько санитарно-показательных микроорганизмов. Присутствие в почве определенных концентраций кишечной палочки (Е.coli) и фекального стрептококка (Streptoccocus faecalis) указывает на свежее фекальное загрязнение, бактерий родов Citrobacter и Епtеrоbасtеr — на несвежее, а Clostridium perfringens — на давнее фекальное загрязнение.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы с целью предупредительного надзора проводят по расширенному перечню показателей. Определяют коли-индекс — количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1 г почвы, перфрингенс-титр — наименьшую массу почвы в граммах, в которой обнаруживаются особи Clostridium perfringens, общую численность сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы.

Точечные пробы отбирают на пробной площадке из одного или нескольких слоев или горизонтов методом конверта. Выкапывается шурф 0,3 м x 0,3 м и глубиной 0,2 м. Поверхность одной из стенок шурфа очищают стерильным ножом. Затем из этой стенки вырезают почвенный образец, размер которого обусловлен заданной навеской, так, если необходимо отобрать 200 г почвы, размер образца 20 см x 3 см x 3 см, 500 г — 20 см x 5 см x 3 см. Точечные пробы отбирают ножом, шпателем или почвенным буром.

Объединенную пробу составляют путем смешивания точечных проб, отоб-

ранных на одной пробной площадке. Для бактериологического анализа с одной пробной площадки составляют 10 объединенных проб. Каждую объединенную пробу составляют из трех точечных проб массой от 200 до 250 г каждая, отобранных послойно с глубины от 0 до 5 см, от 5 см до 20 см. Времяот отбора проб до начала их исследования не должно превышать 1 суток.

Для приготовления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный, плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем. Перед посевом почву просевают через сито диаметром 3 мм.

Для учета почвенных микроорганизмов достаточно навески от 1 до 10 г. В навеску почвы добавляют небольшое количество стерильной водопроводной воды до получения пастообразного состояния почвы, растирая ее в течение 5 минут. Из суспензии делают раститровку. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде (колба), добавляя к суспензии стерильную водопроводную воду в соотношении 1: 9 к весу почвы (например: 1 г почвенной суспензии разводят в 9,0 мл стерильной водопроводной воды, 10 г почвы — в 90 мл воды и т.д.). Приготовленые разведения суспензируют на шейкере 10-20 мин. За это время оседают грубые минеральные частицы почвы.Для приготовления последовательно убывающих концентраций почвы, из первого разведения, находящегося во флаконе, с содержанием почвы 0,1 г (10 -1) отбирают стерильной пипеткой 1,0 мл и переносят в пробирку с 9,0 мл стерильной водопроводной воды. При этом получают второе

разведение, содержащее 0,01 г/мл (10-2 ) почвы. Повторяя эту операцию, доводят разведение почвы до 0,0001 — 0,00001 г/мл (10-4 — 10 -5). Для приготовления каждого разведения используют отдельные пипетки. Приготовленные разведения используются для посева на различные питательные среды.

Титрационный метод определения индекса БГКП в почве

Из первого разведения почвенной суспензии (1:10), прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой берут 10,0 мл, засевают во флаконы с 90,0 мл жидкой лактозо-пептонной среды (ЛПС) или среды Кесслера, что со-ответствует засеву 1 г почвы. Соотношение между навеской почвы или ее эквивалентным разведением и питательной средой 1:9, а для сред двойной концентрации — 1:1.

Посев меньших количеств (0,01 г, 0,001 г, то есть 10-2 , 10-3 и т.д.) делают по 1,0 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии в про-бирки с 9,0 мл тех же сред. Титрование проводят до разведения 1:1000000, то есть 10-6 с регулярной сменой пипеток при переходе от одного разведения к другому. Посевы инкубируют в течение 48 ч при 370 C, через 24 ч инкубации проводят предварительную оценку посевов.

Отсутствие газообразования и помутнения через 48 ч инкубации выдают окончательный отрицательный ответ. При наличии в посевах признаков роста: помутнения и газообразования или только помутнения — производится высев на поверхность среды Эндо.

Чашки с посевами помещают в термостат на 18 — 24 ч при температуре 37 0C. При отсутствии роста на чашках выдают отрицательный ответ. При наличии на поверхности среды Эндо розовых или красных колоний, малиновых с металлическим блеском или без него проводят микроскопию колоний с последующей постановкой оксидазного теста. Оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Еnterobacteriaceae от бактерий рода Pseudomonoas и других видов сапрофитных бактерий.

При наличии оксидазоотрицательных Гр - палочек по 2 -3 колонии каждого типа засевают параллельно в 2 пробирки в полужидкую или жидкую с поплавком среду с лактозой, разлитую в пробирки в количестве 4,0 — 5,0 мл, для подтверждения ферментации лактозы при температуре 37 0C. Учет производят через 18 ч инкубации. Если за это время происходит образование кислоты и газа, это свидетельствует о наличии бактерий группы кишечных палочек. Признаком газообразования является появление пузырьков газа, об образовании кислоты свидетельствует изменение цвета среды. При появлении только кислоты пробирки оставляют втермостате для окончательного ответа еще на 24 ч, при отсутствии газообразования через этот срок выдают окончательный отрицательный ответ, при появлении газообразования — положительный ответ. После выявления БГКП устанавливают титр, при этом принимается то предельное разведение почвы, в котором обнаруживаются колиформы.

Для перевода титра в индекс необходимо 1000 разделить на число, выражающее титр. Так, при титре 0,01 индекс равен 100, а при титре 0,1 индекс равен 10.

Определение C. perfringens в почве

Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.

Из приготовленных почвенных разведений (до 1:10-6 ), прогретых при температуре 75 0 C в течение 20 минут для исключения вегетативных форм, по 1,0 мл переносится в два параллельных ряда пробирок. Затем во все пробирки на-ливают по 9 — 10 мл горячего железосульфитного агара и прогретого до 70- 80 0C (среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков). Для создания анаэробных условий роста пробирки быстро охлаждают, помещая в емкости с холодной водой. Посевы инкубируют при 44 0C в течение 16 — 18 часов. При росте в среде черных крупных колоний (грамположительные, каталазоотрицательные) выдают положительный ответ о присутствии С. perfringens в 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическое исследование воды

Вода и почва, является естественной средой обитания разнообразных бактерий, грибов, вирусов, микроскопических водорослей, простейших. В водоемах различают собственную (аутохтонную) и заносную (аллохтонную) микрофлору, поступающую из почвы, воздуха, живых организмов. В воде, как и в почве, происходят биологические процессы очищения от несвойственной (аллохтонной) микрофлоры.

Концентрация водных микроорганизмов определяется содержанием в воде органических веществ. Наиболее чисты грунтовые подземные воды, так как после просачивания через почву большинство микробов задерживается в фильтрующем слое. Значительно больше микробов в открытых водоемах, что связано с высоким содержанием растворенных питательных органических веществ, которые поступают со сточными и канализационными водами, отходами предприятий. Вода имеет важное санитарно-эпидемиологическое значение как фактор передачи возбудителей многих инфекций, особенно кишечных, которые с испражнениями больных и носителей поступают в открытые водоемы, а оттуда нередко — и в питьевую воду.

Споры возбудителя сибирской язвы годами могут сохраняться в воде; месяцы переживают в воде сальмонеллы, лептоспиры, вирусы полиомиелита и гепатита А, меньше (дни, недели) выживают возбудители дизентерии, холеры, бру-целлеза, туляремии, условно-патогенные энтеробактерии. В теплое время года благодаря большей активности процессов самоочищения воды продолжитель-ность жизни бактерий короче, в холодной воде, соответственно, дольше. Во льду возбудители кишечных инфекций могут сохраняться в течение нескольких недель и месяцев.

Санитарно-микробиологическое исследование воды проводится с целью теку-щего надзора, то есть в плановом порядке, а также по специальным эпидемио-логическим показаниям.

Требования к качеству воды разных объектов, методы исследований и крите-рии оценки результатов представлены в нормативных актах — государственных стандартах (ГОСТ), санитарных правилах и нормах, методических указаниях.

Основными официально регламентированными показателями качества сани-тарно-микробиологического состояния воды в настоящее время являются:

  • общее микробное число (ОМЧ);
  • наиболее вероятное число колиформных бактерий;
  • наиболее вероятное число термотолерантных колиформных бактерий;
  • наличие спор сульфитредуцирующих клостридий;
  • количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) бактериофага E.coli.

При необходимости расследования водных вспышек инфекционных заболе-ваний проводят более детальное санитарно-микробиологическое исследование воды, определяя наличие энтерококков, сальмонелл, холерного вибриона, энтеровирусов.

Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками.

Отбор проб из крана производят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин при открытом кране. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок.

При отборе хлорированной воды в емкость до ее стерилизации вносят серноватистокислый натрий из расчета 18 — 20 мг на 500 см3 пробы сточной воды.

При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании. Срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 ч.

Определение общего микробного числа

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24. Исходную пробу воды титруют проводят до разведения 1:1000000, то есть 10-6 .

Из каждого разведения делают посев не менее двух объемов по 1 мл в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. После внесения воды в каждую чашку вливают (8—12) мл (на чашку диаметром 90—100 мм) расплавленного и остуженного до (45—49) °С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до застывания агара. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч. Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 изолированных колоний. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды (см. формулу 6.3).

Если на одной из 2 чашек подсчет невозможен, результат выдают на основании учета колоний на одной чашке. Если на двух чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность.

Определение числа бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

При исследовании питьевой воды из системы централизованного водоснабжения анализируют 333 мл, профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра. При исследовании питьевой воды децентрализованного водоснабжения анализируют не менее 100 мл воды. Каждую пробу воды профильтровывают не менее чем через три фильтра (например, можно фильтровать по 100, 10 и 1 мл). Объемы воды для посева выбраны правильно, если на 1 — 2-х фильтрах выросли изолированные колонии, среди которых не более 30 колоний относятся к бактериям группы кишечных палочек.

Для фильтрования используют мембранные фильтры со средним диаметром пор 0,45 мкм и размером 35 или 47 мм в диаметре (отечественные фильтры «Владипор» МФАС–0С–1, МФАС–0С–2, МФАС–МА (№ 4–6) или зарубежные — ISO 9000 или EN 29000), прибор для фильтрования под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 32 мм и с приспособлением для создания вакуума.Сухие стерильные мембранные фильтры перед фильтрованием смачивают в стерильной дистиллированной воде. Фильтры помещают на среду Эндо и термостатируют при (37 ± 2) °С в течение 18 — 24 ч.

При отсутствии какого-либо роста на фильтрах или при наличии только пленчатых, губчатых с неровной поверхностью и краями, плесневых и других не характерных для кишечных палочек колоний дают отрицательный ответ. Анализ на этом заканчивают через 18 — 24 ч.

При росте на фильтрах колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском и без него, красных, розовых слизистых, розовых с темным центром, бесцветных) выполняют оксидазный тест. Мембранный фильтр колониями вверх переносят на кружок фильтровальной бумаги, смоченной реактивом для определения оксидазной активности. Учитывая бактерицидность реактивов для определения оксидазной активности, мембранный фильтр сразу после проявления реакции следует перенести обратно на среду Эндо и не позднее 5 — 7 мин пересеять оксидазоотрицательные колонии в полужидкую среду с глюкозой (если это необходимо по дальнейшему ходу анализа). Наличие активной оксидазы (изменение цвета колоний на сине-фиолето-вый) у всех колоний, за исключением не характерных для БГКП, позволяет дать отрицательный ответ и закончить анализ через 18 — 24 ч.

Если выросли колонии, не обладающие оксидазной активностью, то из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Отсутствие в мазках грамотрицательных, не образующих спор палочек, позволяет дать отрицательный ответ и закончить анализ через 18 — 24 ч.

Если красные и темно-красные колонии с металлическим блеском и без него (лактозоположительные) образованы грамотрицательными палочками, не обладающими оксидазной активностью, то их число подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 мл воды. Вычисления проводят по формуле:

X=\frac{a\cdot 100}{v}

где:

  • х — число колоний в 100 мл;
  • v — объем воды, профильтрованной через фильтры, на которых велся учет;
  • а — число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.

В сомнительных случаях, когда нет уверенности, что колонии образованы бактериями, ферментирующими лактозу, а также при наличии на фильтрах розовых, розовых с центром, бесцветных колоний грамотрицательных и оксидазоотрицательных палочек, их подсчитывают (каждый тип колоний отдельно) и принадлежность к БГКП подтверждают посевом двух-трех изолированных колоний каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет производят через 4 — 5 ч инкубации посевов при 37 °С. При образовании кислоты и газа результат считают положительным, при отсутствии кислоты и газа — отрицательным. Анализ заканчивают через 24 — 28 ч. При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного учета газа через 24 ч.

Подсчитывают сумму лактозоположительных колоний и тех из лактозоотрицательных, которые ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа при 37 °С в течение 24 ч.

Титрационный метод определения бактерий группы кишечных палочек с использованием среды КОДА

Среда имеет в своем составе ингибитор, не требует строгой асептики и не теряет свойств под воздействием света. Ориентировочный ответ может быть дан по изменению цвета индикатора. Для посева 1 мл воды и ее разведений используют среду нормальной концентрации. Для посева 10, 50 и 100 мл воды используют соответствующие объемы среды двойной концентрации, увеличивая количество сухого препарата на тот же объем воды в 2 раза.

При исследовании питьевой воды централизованного водоснабжения засевают 3 объема по 100 мл, 3 объема по 10 мл и 3 объема по 1 мл. При исследовании питьевой воды децентрализованного водоснабжения засевают 1 объем по 50 мл, 5 объемов по 10 мл и 5 объемов по 1 мл. 100 и 10 мл воды вносят во флаконы и пробирки с 100 и 10мл концентрированной среды КОДА. 1 мл воды и 1 мл из разбавлений вносят в пробирки с 10 мл среды нормальной концентрации. Посевы инкубируют при 37 °С.

Результаты учитывают предварительно через 24 ч, окончательно — через 48 ч. Положительным считается появление мути и изменение цвета индикатора. Коли-индекс высчитывают по таблице 5.

Таблица 5. Таблица расчета наиболее вероятного числа микроорганизмов (расчет наиболее вероятного числа бактерий в 100 мл питьевой воды)

Число положительных результатов из:

НВЧ

Доверительный интервал (95%)

3 объемов по 100 мл

3 объемов по 10 мл

3 объемов по 1 мл

бактерий в 100 мл

нижний

верхний

1

2

3

4

5

6

0

0

1

0,3

0

1,4

0

0

2

*1

0

0

3

*

0

1

0

0,3

0,1

1,4

0

1

1

*

0

1

2

*

0

1

3

*

0

2

0

0,6

0,1

2,8

0

2

1

*

0

2

2

*

0

2

3

*

0

3

0

*

0

3

1

*

0

3

2

*

0

3

3

*

1

0

0

0,4

0,1

1,7

1

0

0

0,7

0,2

3,4

1

0

2

*

1

0

3

*

1

1

0

0,7

0,2

3,4

1

1

1

1,1

0,2

5,2

1

1

2

*

1

1

3

*

1

2

0

1,1

0,2

5,3

1

2

1

*

1

2

2

*

1

2

3

*

1

3

0

*

1

3

1

*

1

3

2

*

1

3

3

*

2

0

0

0,9

0,2

4,3

2

0

1

1,4

0,3

6,7

2

0

2

*

2

0

3

*

2

1

0

1,5

0,3

6,9

2

1

1

2

0,4

9,6

2

1

2

*

2

1

3

*

2

2

0

2

0,5

9,9

2

2

1

3

0,6

12,9

2

2

2

*

2

2

3

*

2

3

0

3

0,6

133

2

3

1

*

2

3

2

*

2

3

3

*

3

0

0

2

0,5

10,8

3

0

1

4

0,8

18,0

3

0

2

6

1,4

29,7

3

0

3

*

3

1

0

4

0,9

20,0

3

1

1

8

1,6

35,0

3

1

2

12

2,5

53,8

3

1

3

*

3

2

0

9

2,0

43,6

3

2

1

15

3,2

69,8

3

2

2

21

4,6

100,3

3

2

3

29

6,2

136,4

3

3

0

24

5,1

112,1

3

3

1

46

9,3

216,0

3

3

2

110

23,5

516,6

3

3

3

³ 240

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха

Недостаток влаги и питательных веществ, солнечная радиация препятствуют размножению микроорганизмов в атмосферном воздухе. Микробы поступают в воздух с поверхности почвы и растений, с отходами некоторых производств, из животных организмов. Микрофлора атмосферного воздуха зависит от интен-сивности солнечной радиации, ветра, осадков, характера почвы, времени года. При чихании, кашле, разговоре из верхних дыхательных путей человека в воздух выбрасывается множество капелек слизи с эпителиальными клетками и микроорганизмами.

Воздушно-капельным путем происходит передача возбудителей так назы-ваемых респираторных инфекций — гриппа и кори, туберкулеза, коклюша, дифтерии, краснухи, ветряной оспы, паротита. Микробный аэрозоль может стать причиной развития аллергических заболеваний, особенно при наличии в воздухе плесневых грибов и актиномицетов.

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха имеет целью контроль состояния воздушной среды закрытых помещений: холодильных камер, а также кондитерских цехов. Оно предусматривает определение общего содержания микроорганизмов и количества стафилококков в 1 м3воздуха(табл. 5)

Таблица 5. Бактериологические показатели чистоты воздуха закрытых помещений

Оценка воздуха

Всего микробов

Стафилококков (зеленящих и гемолитических)

Летний период

Чистый

1500

16

Загрязненный 2500 36

Зимний период

Чистый

4500

36

Загрязненный 7000 124

Существует несколько методов оценки состояния воздуха по СПМО.

Метод естественной седиментации или метод Коха

Осаждение микробных частиц и капель происходит под действием силы тяжести и нисходящих токов воздуха на поверхность плотной питательной среды в открытой чашке Петри.

Чашка Петри с МПА (для определения ОМЧ), кровяным агаром (для определения гемолитических стафилококков) или средой Сабуро оставляют открытыми на 5, 10, 15 мин и более. Затем их закрывают крышками и ставят в термостат перевернув их вверх дном. Посевы на чашках с МПА и кровяным агаром выдерживают при 30—37°С в течение 48 ч, на среде Сабуро — при температуре не выше 24-26°С 6-8 сут., а затем проводят подсчет выросших колоний.

По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха, пользуясь правилом Омельянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100 см2 в течение 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Каждая микробная клетка дает начало одной колонии. Зная количество выросших колоний и время экспозиции, вычисляют количество микробов, содержащихся в 1 м3 (1000 л) воздуха.

Аспирационный метод с использованием аппарата Кротова

Определение микробного загрязнения воздуха аспирационным методом осуществляют с помощью пробозаборников инерционного типа — импактора или прибора для бактериологического анализа воздуха (щелевой аппарат Кротова, отсюда еще одно название метода: щелевой метод улавливания бактерий). В основу действия прибора положен принцип удара струи воздуха о поверхность питательной среды, которая помещается в чашке Петри.

При использовании аппарата Кротова воздух с помощью центробежного вентилятора всасывается через клиновидную щель, расположенную по радиусу над чашкой Петри. Диск, на котором закреплена чашка Петри, вращается со скоростью 1 оборот/сек, вследствие чего посев микроорганизмов происходит равномерно по всей поверхности питательной среды.

Местоположение и количество точек взятия проб воздуха определяют в зависимости от размеров помещения (см. метод седиментации). Чашку Петри с питательной средой помещают на диск прибора, тщательно закрывают крышку с помощью зажимов, установленных на его корпусе. Прибор включают в сеть, с помощью реометра устанавливают скорость движения воздуха — 25 или 40 л/мин. В среднем пробу воздуха отбирают в течение 10 мин со скоростью 25 л/мин.

После взятия пробы воздуха (из каждой определенной точки на две параллельные чашки Петри с МПА и средой Сабуро), чашки закрывают крышками и помещают в термостат. Питательные среды, температурный режим и время инкубации посевов такие же, как при исследовании воздуха методом седиментации (см. выше).

Учет результатов

Расчет осуществляют по формуле:

X=\frac{a\cdot x \cdot 1000}{v}

где

  • X — число микроорганизмов в 1 м3 воздуха;
  • а — количество колоний, которые выросли на чашке Петри после срока инкубации;
  • v — объем исследуемой пробы воздуха.

Аналогом аппарата Кротова является импактор «Флора-100» (рис. 21).

Импактор воздуха микробиологический

Рисунок 21. Импактор воздуха микробиологический

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

  1. Микрофлора почвы.
  2. Показатели фекального загрязнения почвы. Оценка санитарно-бактериологического состояния почвы.
  3. Микрофлора воды, степени микробного загрязнения воды.
  4. Оценка санитарно-бактериологического состояния воды.
  5. Микрофлора воздуха и его санитарно-бактериологическая оценка.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

  1. Изучить основные методы и показатели, необходимые для санитарно-бактериологической оценки объектов окружающей среды.
  2. Определить присутствие Е.соli на коже рук и предметах обихода методом смывов; сделать заключение.
  3. Определить микрофлору зубного налета на основании данных бактериологического исследования.

СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ

  1. В учебной комнате были оставлены открытыми две чашки Петри с питательным агаром, которые простояли в течение 60 мин. и были подвержены последующей инкубации в термостате при 37 °С. На следующий день число выросших колоний на обеих чашках составило 200 колоний. Как называется данный метод исследования воздуха? О чем свидетельствуют полученные результаты?
  2. Коли-титр почвы равен 0,9, перфрингенс-титр — 0,0009, индекс термофилов — более 1000. К какой категории следует отнести такую почву?

ТЕМА № 9. Санитарная микробиология пищевых продуктов. Пищевые токсикоинфекции и интоксикации

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Освоение студентами методов санитарно-бактериологического анализа пищевых продуктов, микробиологического анализа пищевых токсикоинфекций и интоксикаций, а также методов проведения смывов на пищеблоке; формирование умения правильно оценивать результаты этих исследований.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Методы санитарно-бактериологического анализа пищевых продуктов и проведения смывов на пищеблоках.
  2. Методы микробиологических исследований при пищевых токсикоинфекциях и интоксикациях.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Оценивать результаты этих исследований согласно существующим нормативным документам.

Санитарная микробиология мясных продуктов

Одним из важнейших условий защиты мяса от обсеменения микробами яв-ляется строгое выполнение всех требований ветеринарного надзора за живот-ными в предубойный период и соблюдение санитарно-гигиенического режима в процессе приготовления мясопродуктов.

Мясо здорового животного обычно стерильно, так как в физиологических условиях стенка кишечника непроницаема для микроорганизмов. Утомление, длительное голодание и болезни животных, предназначенных к убою, способ-ствуют нарушению физиологических барьеров и проникновению микроорга-низмов из кишечного тракта через кровеносную и лимфатическую системы в органы и ткани животных.

При горизонтальном обескровливании животных микроорганизмы могут проникать в венозную систему и распространяться по тканям.

Мясо для многих микроорганизмов является хорошим питательным суб-стратом, в котором они находят все необходимые для себя вещества — углерод, азот, витамины, минеральные соли. Помимо прижизненного инфицирования, мускулы могут обсеменяться микробами после убоя животного — при первич-ной обработке и разделке туш (особенно если повреждается кишечник) через инструменты, с рук и одежды рабочих, а также при транспортировании, хра-нении, разрубе в магазинах и т. д. Поэтому даже свежевыработанное мясо не является стерильным, и в нем (преимущественно на поверхности) содержится то или иное количество микроорганизмов.

Обсемененность свежевыработанного охлажденного мяса микроорганизмами может быть различной в зависимости от степени созревания мяса, темпера-турно-влажностного режима охлаждения, санитарно-гигиенических условий выработки и др. На 1 см2 поверхности насчитывают тысячи, десятки и сотни тысяч клеток. Состав микрофлоры разнообразен. Преимущественно это аэроб-ные и факультативно-анаэробные, бесспоровые, грамотрицательные палоч-ковидные бактерии родов Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Aeromonas, бактерии группы кишечной палочки и протея, коринеформные бактерии, мо-лочнокислые микрококки. В меньших количествах обнаруживают аэробные и анаэробные спорообразующие бактерии, дрожжи, споры плесеней. Среди этих микроорганизмов немало возможных возбудителей, провоцирующих порчу мяса, способных активно воздействовать на белки, жир и другие вещества, входящие в его состав.

Мясо может быть инфицировано и токсигенными бактериями, например, Clostridium perfringens, сальмонеллами, Bacillus cereus, энтерококками. Сальмонеллы нередко вызывают кишечные заболевания у рогатого скота, после чего животные длительно являются бациллоносителями. Проникновение саль-монелл в мышцы возможно при жизни животного. При значительном разм-ножении этих бактерий мясо может послужить причиной отравлений.

Мясные субпродукты (мозги, почки, сердце и др.) обычно более обсеменены микробами, чем мясо, и поэтому подвергаются более быстрой порче.

Бактериологическое исследование консервов

Консервы (от латинского conservo — сохраняю) — пищевые продукты, приготовленные из предварительно обработанного животного или раститель-ного сырья, укупоренные в жестяную или стеклянную тару и подвергнутые стерилизации в целях предохранения их от порчи при длительном хранении.

Консервы подразделяются на три основные группы: собственно консервы (полные консервы), полуконсервы и пресервы. К первой группе относятся консервы, микробиологическая стабильность которых не зависит от продол-жительности хранения при температуре, указанной на данный вид продукции.

Полуконсервы (мясные, ветчинные, шпик, сосиски) стерилизуют при 100-110 0С. Их безопасность и сохранность гаранитируются при темпераратуре от 2 до 15 0С.

Продукты, консервированные без применения термической стерилизации, принято называть пресервами (от французского рrеserver — предохранять). Они могут храниться лишь короткое время и только при пониженной температуре (не ниже 0 °С и не выше 5 °С).

Использование высокой температуры является одним из наиболее распро-страненных способов консервирования пищевых продуктов. Стерилизации обычно подвергают консервы мясные, мясорастительные, рыбные, консервы для диетического питания, соки овощные и др. Такие консервы при их правильной стерилизации и герметичности тары могут сохраняться годами.

Существуют и другие способы консервирования (пастеризация, заморажива-ние, сушка, соление, маринование, квашение, копчение, путем применения сахара, антибиотиков, химически чистых антисептиков и ряд других), которые направлены либо на уничтожение микроорганизмов, либо на временное прекра-щение их жизнедеятельности (например, путем высушивания).

Стерилизацию консервов производят в автоклавах под давлением. Уровень температуры и длительность ее воздействия устанавливают в зависимости от размеров тары, вида продукта, его кислотности, жирности, консистенции и других факторов. Важное значение имеет уровень микробной обсемененности консервируемого продукта, который перед стерилизацией не должен быть выше допустимого предела. Консервы в стеклянных банках стерилизуют при меньшей температуре, но более длительное время по сравнению с консервами в жестяной таре. Обычно стерилизацию продолжают в течение 40-90 мин. при температурах от 108 °С до 120 °С.

В промышленности лишь для консервов особого назначения добиваются абсолютной стерильности, для большинства же консервов требуется промышленная стерильность.

Критериями безопасности консервированных пищевых продуктов (промышленная стерильность) является отсутствие в консервированном продукте микроорганизмов, способных развиваться при температуре хранения, установленной для конкретного вида консервов, а также микроорганизмов и микробных токсинов, опасных для здоровья человека.

Остаточная микрофлора консервов представлена главным образом споро-образующими формами микробов. Среди них чаще всего встречаются как аэробные микроорганизмы — В. subtilis, В. mesentehcus, так и анаэробные — С. sporogenes, С. putrificus и др. Значительную долю остаточной микрофлоры консервов составляют термофильные микробы. Некоторые из них в процессе своей жизнедеятельности образуют газообразные продукты и вызывают порчу консервов со вздутием банок — бомбаж. Другие не дают газообразования и вызы-вают так называемую плоскокислую порчу.

Следует различать бомбаж биологического, химического и физического происхождения.

Биологический бомбаж вызывается газами, образующимися в результате размножения микроорганизмов. Под влиянием их жизнедеятельности происходит разложение белков, жиров и углеводов с образованием газов (H2S, NH3, C02), которые давят на стенки и донышки банки и вызывают ее вздутие. Биологический бомбаж чаще всего вызывается спорообразующими анаэробами и некоторыми термофильными бактериями. Иногда в этом процессе принимают участие факультативные анаэробы Е coli, P. vulgaris и др. Бомбаж фруктовых и молочных консервов нередко бывает обусловлен дрожжами.

Биологический бомбаж с санитарно-гигиенической точки зрения наиболее опасен. Консервы с биологическим бомбажем непригодны в пищу, подлежат браковке и уничтожению, независимо от того, каким видом микроорганизма вызван бомбаж.

Химический, или водородный, бомбаж возникает в результате сильной коррозии металла под влиянием кислого содержимого банки. При взаимодействии кислоты с металлом выделяется газообразный водород, давление которого приводит к изменению внешней формы банок.

Для предотвращения химического бомбажа продукты с повышенной кислот-ностью укладывают в жестяные банки, покрытые с внутренней поверхности специальным кислотоупорным лаком. Консервы с химическим бомбажем практически безвредны, но они не должны выпускаться для реализации в торговую сеть, поскольку невозможно на складах достоверно дифференцировать этот вид бомбажа от бомбажа биологического происхождения.

Физический бомбаж либо является результатом переполнения банки кон-сервированным продуктом, либо обусловлен подмораживанием консервов и расширением содержимого банок вследствие образования в них льда. Фи-зический бомбаж бывает и при вполне доброкачественных консервах, однако реализация их требует осторожности. При подмораживании имеет место обычно массовый бомбаж, но выявить в таких партиях консервов отдельные банки, вздутие которых произошло под влиянием опасных микроорганизмов, невозможно. Консервы с физическим бомбажем вследствие замораживания должны реализоваться только после предварительной варки.

Высокая температура в значительной степени ослабляет остаточную микро-флору, однако последняя может проявить жизнедеятельность через некоторое время, особенно при неправильном хранении консервов.

Эффективным способом контроля доброкачественности консервов является термостатная выдержка. Перед микробиологическим анализом консервы выдерживаются в термостатах от 5-7 до 15 суток при 37°С. Рыбные консервы в масле (шпроты, треска, корюшка и пр.) не подлежат термостатной выдержке. Последняя может способствовать активизации стафилококков, которые вследствие плохой теплопроводности масла иногда сохраняются при термической обработке. Известно, что развитие стафилококков не сопровождается газообразованием, поэтому банки, в содержимом которых стафилококк размножился, выглядели бы нормально, т.е. не вздутыми.

Консервы исследуют на промышленную стерильность, для выявления возбудителей порчи и патогенной (токсигенной) флоры.

Бактериологическое исследование консервов производится при строгом соб-людении правил асептики в стерильном боксе. Банку перед вскрытием тща-тельно протирают водой, затем ватой, смоченной спиртом. Ватный тампон под-жигается в пламени горелки и накладывается на крышку банки. Под горящий тампон подводят острие профламбированного металлического пробойника, прокалывают крышку и, вращая пробойником, расширяют отверстие до 1-1,5 см в диаметре. Взятие образца для посева производят с помощью стеклянной трубки диаметром 7-9 мм, предварительно проверенной на стерильность.

Для выявления мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в пробирки с мясопептонным бульоном с глюкозой вносят пробы консервированного продукта. Посевы выдерживают при 37°С в течение 5 сут. Посевы для выявления термофильных микроорганизмов инкубируют при 55-62сС. За признаками роста наблюдают ежедневно. При появлении помутнения, образовании пленки, выделении пузырьков газа содержимое пробирок микроскопируют и делают пересев в случае необходимости.

Мезофильные бациллы из группы В. subtilis (В. subtilis, В. pumilus, В. licheniformis) выделяют в посевах газа, имеют форму палочек со спорами, положительно или вариабельно окрашиваются по Граму и образуют каталазу.

При отрицательных результатах роста в посевах мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов делают вывод об отсутствии активно развивающихся микроорганизмов этой группы.

Обнаружение в посевах признаков роста микроорганизмов, отличных от бактерий группы В. subtilis, указывает на присутствие другой микрофлоры. В таком случае отмечают характер роста на питательной среде, морфологию клеток (кокки, грамотрицательные палочки, грамположительные неспорообразующие палочки), отношение к каталазе.

Для обнаружения мезофильных анаэробных микроорганизмов производят посев консервированного продукта в среду Китта-Тароцци. Термостатируют посевы при температуре 37°С в течение 5 сут.

Развитие мезофильных анаэробных микроорганизмов в посевах сопровож-дается помутнением среды, выделением газа, появлением постороннего запаха, в некоторых случаях разложением кусочков мяса или печени. В мазках облигатно-анаэробных бактерий присутствуют палочки, окрашивающиеся положительно по Граму и образующие споры.

Санитарно-микробиологическое исследование молока и молочных продуктов

Молоко является весьма благоприятной питательной средой для развития многих микроорганизмов. Различают специфическую и неспецифическую микрофлору молока и молочных продуктов.

К специфической микрофлоре молока и молочных продуктов относят микробов-возбудителей молочнокислого, спиртового и пропионовокислого брожения. Микробиологические процессы за счет жизнедеятельности этих микроорганизмов лежат в основе приготовления кисломолочных продуктов (творога, кефира, простокваши, ацидофилина и др.).

Бактерии молочнокислого брожения считаются нормальной микрофлорой молока и молочных продуктов. Главную роль при скисании молока и молочных продуктов играют молочнокислые стрептококки S.lactis, S.cremaris и другие. В группу молочнокислых бактерий также входят молочнокислые палочки: Lactobacterium bulgaricum, Lactobacterium casei, Lactobacterium acidophilus и т. д.

Основными возбудителями спиртового брожения в молоке и молочных продуктах являются дрожжи (Saccharomyces lactis и др.).

Неспецифическую микрофлору молока составляют гнилостные бактерии (Proteus), аэробные и анаэробные бациллы (В.subtilis, В.megatherium, C.putrificum) и многие другие. Ряд инфекционных заболеваний, таких как дизентерия, бруцеллез, лихорадка Q могут передаваться через молоко.

Плохие условия хранения молока также могут способствовать дальнейшему нарастанию в нем микрофлоры.

Санитарно-микробиологическое исследование смывов с объектов внешней среды

Данные санитарно-микробиологического исследования дают возможность объективно оценить санитарно-гигиеническое состояние обследуемых объектов, выявить нарушения санитарного режима и оперативно проводить целенаправленные мероприятия по их устранению.

Санитарно-микробиологические исследования проводят:

  • при текущем санитарном надзоре за продовольственными объектами;
  • по эпидемиологическим показаниям (при расследовании пищевых отравлении и случаев инфекционных заболеваний);
  • при контроле качества дезинфекции.

Различают несколько способов отбора проб с различного оборудования и инвентаря для микробиологического исследования: способы тампонных смывов, отпечатков, агаровой заливки. Из них наиболее часто используют способ тампонных смывов.

Санитарно-микробиологический контроль основан на обнаружении в смывах бактерий группы кишечных палочек (БГКП)– показателей фекального загрязнения исследуемых предметов. Исследования на стафилококк, патогенные бактерии семейства кишечных, определение общей микробной обсемененности проводят по показаниям. Например, взятие смывов для обнаружения стафилококков необходимо при обследованиях кондитерских цехов, молочных кухонь предприятий общественного питания.

Организация лабораторного контроля за объектами питания и торговли состоит из четырех этапов: подготовительного, этапа проведения обследования, этапа оценки полученных результатов и, в случаях обнаружения нарушений режима, этапа принятия срочных мер по их устранению. Тщательное соблюдение санитарных норм исключает возможность обсеменения предметов БГКП, поэтому факт их обнаружения в смывах является свидетельством нарушения санитарного режима.

Периодичность проведения смывов и их объем определяются конкретной санитарно-эпидемиологической обстановкой. Центры Роспотребнадзора осуществляют лабораторное исследование смывов и контролируют методику их взятия.

Особое внимание уделяется контролю бактериальной загрязненности обору-дования и инвентаря, используемого в процессе производства продукции, не подвергающейся в дальнейшем тепловой обработке (в холодном цехе). Аппаратуру и оборудование подвергают микробиологическому контролю после мойки и дезинфекции (хлорирования или пропаривания) непосредственно перед началом работы.

Взятие смывов производится с помощью стерильных ватных тампонов, закрепленных на палочках и вмонтированных в пробирки со стерильным раствором. Смывы с крупного оборудования‚ инвентаря берут с помощью трафарета площадью 25 см2 . Трафарет накладывается 4 раза в разных местах объекта, чтобы площадь поверхности смыва составила 100 см2 . Тампоны помещают в пробирку с 10 мл стерильной воды (или физиологического раствора), откуда после тщательного перемешивания делают посевы по 1 мл в среду Кесслер и в случае необходимости на общее количество бактерий. Количество выросших колоний умножают на 10 для получения характеристики микробиоты на 100 см2 поверхности.

При взятии смывов с посуды или мелкого инвентаря одним тампоном протирают по три одинаковых предмета — три тарелки, три стакана, три ложки и т. п. Влажным тампоном обтирается вся рабочая или внутренняя поверхность предметов. При взятии смывов с тарелок протирают всю внутреннюю поверхность, у стаканов протирают внутреннюю поверхность и верхний наружный край не менее 2 см, у столовых приборов протирают их рабочую часть.

Смывы берутся с рук, одежды и личных полотенец персонала, работающ-его в холодном и кондитерском цехах, на раздаче и других местах работы с готовыми к употреблению продуктами и пищей.

Одним тампоном протирают ладонные поверхности обеих рук, ногти и подногтевые ложа, а также межпальцевые промежутки. По каждой ладони и пальцам тампоном проводят не менее пяти раз.

На санитарной одежде тампоном протирают 4 участка площадью 25 см2 — сверху и посередине передней части одежды и на нижних частях рукавов. С полотенца берут смывы с четырех различных мест площадью по 25 см 2 каждое.

Пищевые токсикоинфекции и интоксикации

Пищевые отравления — острые, реже хронические, не контагиозные заболевания, возникающие в результате употребления пищи, массивно обсемененной определенными видами микроорганизмов или содержащей токсичные для организма вещества микробной или немикробной этиологии.

Выделяют следующие виды пищевых отравлений:

  • микробные отравления, которые подразделяются на тосикоинфекции и интоксикации или токсикозы (бактериальные и микотоксикозы смешанной этиологии);
  • немикробные отравления, которые включают в себя отравления ядовитыми растениями и тканями животных (ядовитыми по своей природе), отравление продуктами растительного или животного происхождения (ядовитыми при определенных условиях), отравление химическими веществами;
  • отравления неустановленной этиологии.

В соответствии с действующими документами важным является правильный отбор материала при расследовании пищевых отравлений. В качестве такого материала могут служить: остатки пищи, исходные продукты, суточные пробы (при сохранении их на холоде), рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения, моча, кровь для гемокультуры и серологических исследований (8-10 мл), слизь из зева и носа, у работников питания смыв из гнойничков на руках, широкий отбор смывов с разных предметов, соскобы, где их можно взять, питьевая вода, патологоанатомический материал.

Проба опечатывается и отправляется в лабораторию сразу же после взятия, а если необходимо хранение, то при 4-6 0С, но не более 24 ч. В сопроводительном документе описываются эпидемиология, клиника, подозрительный продукт с тем, чтобы его исследовать в первую очередь.

В разных странах в этиологии пищевых отравлений преобладают различные микроорганизмы. Так, например, в России — стафилококки, в Англии — сальмонеллы, в Америке — стафилококки, в Японии — галофильные вибрионы и т. д.

Около половины штаммов золотистого стафилококка -S.aureus продуцируют токсины, которые попадая в пищеварительный тракт, вызывают острейший гастроэнтерит с тяжелой рвотой и профузным поносом. Это наиболее распро-страненная пищевая интоксикация бактериальной природы.

На кровяном агаре стафилококки образуют гемолитические и негемолити-ческие непрозрачные колонии средних размеров белого или золотистого цвета, гладкие, круглые, с ровными краями, диаметром 1-3 мм.

Колонии стафилококков могут быть окружены зоной гемолиза и в большинстве случаев обладают золотистым, палевым или лимонно-желтым пигментом. На среде желточно-солевом агаре вырастают колонии, окруженные видимым при косом освещении радужным венчиком.

Шигеллы и сальмонелы также являются причиной пищевых отравлений, но в классификацию не вошли, поскольку учитываются как самостоятельные заболевания. Значителен процент пищевых отравлений неясной этиологии ( от 22 до 60 %).

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

  1. ГОСТ, которым предусмотрено бактериологическое исследование мяса.
  2. Порядок отбора образцов мяса для анализа.
  3. Микрофлора мяса, причины его обсеменения микроорганизмами.
  4. Методы бактериологического контроля качества мяса.
  5. Бактериологический контроль качества консервов.
  6. Правила отбора проб консервов.
  7. Методы бактериологического исследования консервов.
  8. Микрофлора молока и санитарно-бактериологические показатели качества молока.
  9. Методы санитарно-бактериологического исследования молока.
  10. Санитарно-бактериологический контроль предприятий питания и водоснабжения.
  11. Определение понятий «пищевая токсикоинфекция» и «интоксикация микробной этиологии».
  12. Общая характеристика возбудителей пищевых токсикоинфекций.
  13. Правила отбора проб и доставки их в лабораторию.
  14. Общая характеристика возбудителей пищевых токсикоинфекций.
  15. Схема и методы микробиологической диагностики пищевых токсикоинфекций.
  16. Основные виды пищевых интоксикаций микробной этиологии.
  17. Лабораторная диагностика пищевых интоксикаций микробной этиологи.

РАБОТА ПОД РУКОВОДСТВОМ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ

Во время самостоятельной работы преподаватель осуществляет контроль за соблюдением правил, взятием образцов, а также за техникой выполнения посевов.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

Для подготовки мяса к санитарно-бактериологическому исследованию необходимо: стерильно взятые навески (25-30г) перед посевом гомогенизировать в размельчителе тканей с небольшим количеством 0,1% пептонной воды в соотношении примерно 1:5. При отсутствии гомогенизатора кусочки мяса растирают в стерильной ступке с песком и стерильной водой. Взвесь после ее приготовления отстаивают 15 мин., после чего для исследования используют надосадочную жидкость.

  • приготовить мазки-отпечатки с поверхности и среза мяса, окрасить их по Граму, провести бактериоскопию, определить категорию мяса по свежести; ход исследования и результаты запротоколировать в тетрадь лабораторных занятий;
  • подготовить взвесь мяса и произвести ее посев в среду обогащения, среду Мюллера (20 мл взвеси в 50 мл среды во флаконе) и на чашку Петри со средой Эндо;
  • посев кусочков отварного мяса по Шукевичу производится с целью индикации бактерий рода Proteus; небольшой кусочек мяса вареного аккуратно, стараясь не задеть агар, помещают в конденсационную воду свежескошенного агара; посев инкубируют при 37оС в течение 48 часов — первый просмотр производится через 24 часа инкубации.

После обработки поверхности и вскрытия консервов содержимое банки вносят по 2 мл в 2 пробирки с сахарным бульоном для выявления мезофильных аэробов и в 2 пробирки со средой Китт-Тароцци для выявления мезофильных анаэробов. Перед посевом среду Китт-Тароцци прогревают 25 мин. в кипящей водяной бане и затем быстро охлаждают до 30-40оС. Инкубируют при 37оС — 5 суток.

Производят посев молока пастеризованного в среду Кесслера для определения коли-титра. Засевают: по 1 мл молока в 3 пробирки с 9 мл среды Кесслера и по 0,1 мл молока в 3 пробирки с той же средой (т.е. получаем разведение 10-1 молока). Посевы инкубируют при 43оС в течение 18-24 часов.

Ход исследования заносится в тетрадь протоколов.

Взятие смыва с поверхности стола для санитарно-бактериологического исследования: смывы производят стерильными увлажненными тампонами (увлажняют физиологическим раствором или 0,1 % пептонной водой);

При взятии смывов с мелких предметов (ложки, тарелки) одним тампоном протирают всю поверхность 2-3 одноименных предметов.

При исследовании рук смывы делают с ладонных поверхностей (проводя по каждой ладони не менее 5 раз), пальцев, ногтей, межпальцевых поверхностей.

Смывы со спецодежды производят с площади 100 см2, включая прежде всего нижние части каждого рукава и передние части одежды.

После взятия смыва тампон помещают в пробирку с жидкой питательной средой. На каждой пробирке отмечают порядковый номер, под тем же номерам заносят в список название предмета, с которого сделан смыв. Пробирки с посевами и список доставляют в лабораторию в тот же день. Обтирают тампон о внутренние стенки пробирки и переносят тампон и содержимое пробирки в пробирку со средой Кесслера или КОДА.

Инкубация в термостате при 37оС в течение 24 часов.

Студенты изучают схему диагностики пищевых отравлений и интоксикаций.

СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ

  1. Зарегистрирована вспышка пищевого отравления, связанная с потреблением кондитерских изделий, которые хранились при комнатной температуре и при изготовлении которых использовали утиные яйца. Какие микроорганизмы могли послужить причиной этого заболевания?
  2. В посевах консервов на 3-й день исследования обнаружен рост микроорганизмов в сахарном бульоне. Каковы ваши дальнейшие действия?

Тестовые задания

  1. Основные морфологические разновидности бактерий:
    1. Кокки
    2. Палочки
    3. Извитые
    4. Все вышеуказанное верно
  2. Обязательной структурой бактериальной клетки является
    1. Клеточная мембрана
    2. Аппарат Гольджи
    3. Ядро
    4. Нуклеоид
  3. Выберите правильный ответ. Увеличение иммерсионного объектива равно:
    1. 7
    2. 40
    3. 90
    4. 120
  4. Выберите правильный ответ. Споры необходимы бактериям для
    1. Размножения
    2. Сохранения во внешней среде
    3. Подвижности
    4. Распространения во внешней среде
  5. Выберите правильный ответ. Жгутики необходимы бактериям для:
    1. Размножения
    2. Движения
    3. Сохранения во внешней среде
    4. Дыхания
  6. Выберите правильный ответ. Признаки грамположительных бактерий:
    1. Не окрашиваются
    2. Окрашиваются по Грамму в красный цвет
    3. Окрашиваются по Граму в синий цвет
    4. Окрашиваются в зеленый цвет
  7. Выберите правильный ответ. Признаки грамотрицательных бактерий:
    1. Не окрашиваются
    2. Окрашиваются по Граму в красный цвет
    3. Окрашиваются по Граму в синий цвет
    4. Окрашиваются в зеленый цвет
  8. Извитые бактерии:
    1. Актиномицеты
    2. Спириллы
    3. Микобактерии
    4. Все вышеуказанное неверно
  9. Выберите правильный ответ. Эукариоты -это:
    1. Простейшие
    2. Бактерии
    3. Грибы
    4. Прионы
  10. Выберите правильный ответ. Микроорганизмы, не имеющие клеточного строения:
    1. Бактерии
    2. Простейшие
    3. Грибы
    4. Вирусы
  11. При культивировании бактерий учитывают:
    1. Тип дыхания бактерий
    2. Питательные потребности бактерий
    3. Температурный режим
    4. Все вышеперечисленное верно
  12. Продуценты природных антибиотиков:
    1. Грибы
    2. Актиномицеты
    3. Бактерии
    4. Все вышеперечисленное верно
  13. Признаки дрожжей:
    1. Имеют ядро
    2. Размножаются делением пополам
    3. Не имеют клеточной стенки.
    4. Имеют капсулу
  14. Выберите правильный ответ. По отношению к кислороду микроорганизмы делят на группы:
    1. Аэробы
    2. Анаэробы
    3. Факультативные анаэробы
    4. Все вышеуказанное верно
  15. Ферменты — это:
    1. Продукты брожения
    2. Специфические катализаторы химических реакций
    3. Запасные питательные вещества
    4. Опорный каркас клетки
  16. Выберите правильный ответ. К методам стерилизации под действием температуры относятся:
    1. Тиндализация
    2. Пастеризация
    3. Автоклавирование
    4. Все вышеуказанное верно
  17. Продуктами микробиологического разложения белка являются:
    1. Птомаины
    2. Амины
    3. Вода
    4. Все верно
  18. Выберите правильный ответ. К пастеризации относится:
    1. Уничтожение спор микроорганизмов
    2. Нагрев вина, пива, соков до температуры 65-80 0 С в течение 10 -60 мин.
    3. Прогревание пищевых продуктов до температуры 600 в течение 10-60 мин.
    4. Обработка продуктов текущим паром
  19. Выберите правильный ответ. Сальмонеллы вызывают:
    1. Брюшной тиф
    2. Холеру
    3. Дизентерию
    4. Ботулизм
  20. К ботулизму относятся:
    1. Пищевая токсикоинфекция
    2. Палочка Clostridium botulinum
    3. Палочка Сlostridium tetani
    4. Сенная палочка
  21. Выберите правильный ответ. Для стерилизации пищевых продуктов, не переносящих нагревания, применяют:
    1. Автоклавирование
    2. Пастеризацию
    3. Стерилизацию сухожаровую
    4. Тиндализацию
  22. Выберите правильный ответ. Требования, предъявляемые к дезинфицирующим средствам:
    1. Хорошо растворяться в воде
    2. Не оказывать токсическое действие на людей и животных
    3. Достаточно долго сохранять бактерицидные свойства
    4. Все вышеуказанное верно
  23. Выберите правильный ответ. К дезинфицирующим средствам относятся:
    1. Галогенсодержащие вещества
    2. Глюкоза
    3. Поваренная соль
    4. Азот
  24. По типу питания микроорганизмы разделяются на:
    1. Автотрофы
    2. Галлофилы
    3. Сапрофиты
    4. Паразиты
  25. Выберите правильный ответ. В соответствии с требованиями СанПиНа в кисломолочных продуктах определяют:
    1. Общее микробное число
    2. Бактерии группы кишечной палочки
    3. Дрожжи
    4. Сенную палочку
  26. Выберите правильный ответ. Виды бомбажа консервов:
    1. Биологический
    2. Химический
    3. Физический
    4. Все вышеуказанное верно
  27. Выберите правильный ответ. Причиной биологического бомбажа является:
    1. Коррозия металла
    2. Жизнедеятельность микроорганизмов
    3. Переполнение банки консервированным продуктом
    4. Подмораживание
  28. Выберите правильный ответ. Бомбажные банки:
    1. Подлежат уничтожению
    2. Подлежат вторичной переработке с целью дальнейшего использования в пищу
    3. Дальнейшему хранению
    4. Бактериологическому исследованию
  29. Исследование консервов на промышленную стерильность заключается:
    1. В выделении аэробов и анаэробов
    2. В выделении стафилококка
    3. В выделении кишечной палочки
    4. В выделении сальмонелл
  30. Санитарно-показательные микроорганизмы –это:
    1. Микроорганизмы, которые постоянно обитают в естественных полостях тела человека и животных
    2. Не выделяются во внешнюю среду
    3. Не обитают в естественных полостях тела человека и животных
    4. Патогенные микроорганизмы
  31. Выберите правильный ответ. Бактерии группы кишечной палочки –это
    1. Грамотрицательные палочки
    2. Не образующие спор палочки
    3. Палочки, растущие при 370 С
    4. Все вышеуказанное верно
  32. Выберите правильный ответ. Титр
    1. это минимальное количество субстрата (в мл или г), в котором еще обнаруживаются санитарно-показательные микроорганизмы.
    2. это максимальное количество субстрата (в мл или г), в котором еще обнаруживаются санитарно-показательные микроорганизмы.
    3. это минимальное количество субстрата (в мл или г), в котором не обнаруживаются санитарно-показательные микроорганизмы.
    4. это максимальное количество субстрата (в мл или г), в котором не обнаруживаются санитарно-показательные микроорганизмы
  33. Выберите правильный ответ. Индекс
    1. - это количество, санитарно-показательных микроорганизмов, которое содержится в 1 л воды или в 1 мл другого субстрата.
    2. это количество, санитарно-показательных микроорганизмов, которое содержится в 1 мл воды.
    3. это максимальное количество субстрата (в мл или г), в котором не обнаруживаются санитарно-показательные микроорганизмы
    4. это минимальное количество субстрата (в мл или г), в котором не обнаруживаются санитарно-показательные микроорганизмы.
  34. Санитарно-показательные микроорганизмы в воде централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения
    1. Общие колиформные бактерии (ОКБ)
    2. Общее микробное число (ОМЧ)
    3. Споры сульфитредуцирующих клостридий
    4. Все вышеуказанное верно
  35. Выберите правильный ответ. Дезинфекция:
    1. это уничтожение во внешней среде только определенных возбудителей инфекционных заболеваний
    2. это уничтожение во внешней среде всех возбудителей инфекционных заболеваний
    3. это полное уничтожение во внешней среде всех микроорганизмов
    4. Все вышеуказанное верно
  36. Выберите правильный ответ. К дезинфицирующим веществам относятся
    1. Кислородсодержащие вещества
    2. Поверхностно-активные вещества
    3. Соединения тяжелых металлов
    4. Все вышеуказанное верно
  37. Выберите правильный ответ. Стерилизация:
    1. освобождение от всего живого, полное уничтожение в продуктах всех микроорганизмов и их спор
    2. это уничтожение во внешней среде всех возбудителей инфекционных заболеваний
    3. это полное уничтожение во внешней среде всех микроорганизмов
    4. это уничтожение во внешней среде только определенных возбудителей инфекционных заболеваний
  38. Выберите правильный ответ. К механическим методам стерилизации относится:
    1. Кипячение
    2. Фильтрование
    3. УФ-облучение
    4. Выхлопывание
  39. Выберите правильный ответ. Антибиотики — это:
    1. Дезинфицирующие вещества
    2. Вещества биологического происхождения
    3. Антисептики
    4. Все вышеуказанное верно
  40. Назначение питательных сред:
    1. Дифференциация бактерий по серологическим свойствам.
    2. Выделение простейших
    3. Для выделения чистой культуры искомых бактерий.
    4. Все вышеуказанное неверно
  41. Оптическая часть микроскопа состоит из:
    1. Тубуса
    2. Штатива
    3. Предметного столика
    4. Зеркала
  42. К механической части микроскопа относится:
    1. Тубус
    2. Конденсор
    3. Объектив
    4. Окуляр
  43. Выберите правильный ответ. Мясо-пептонный бульон — это среда
    1. Универсальная
    2. Специальная
    3. Дифференциально-диагностическая
    4. Элективная
  44. Выберите правильный ответ. Фитонциды:
    1. Это вещества, выделяемые высшими растениями и обладающие антимикробным действием
    2. Это вещества, выделяемые животными и обладающие антимикробным действием
    3. Это вещества, выделяемые бактериями и обладающие антимикробным действием
    4. Это вещества, выделяемые вирусами и обладающие антимикробным действием
  45. Особенности роста микроорганизмов на жидких питательных средах:
    1. Образуют пленку
    2. Образуют муть
    3. Образуют осадок
    4. Все вышеуказанное верно
  46. Выберите правильный ответ. Санитарно-показательные микроорганизмы, определяемые в воздухе:
    1. Общее микробное число
    2. Количество колоний стафилококка
    3. Количество плесневых и дрожжевых грибов
    4. Все вышеуказанное верно
  47. Выберите правильный ответ. Чтобы определить увеличивающую способность микроскопа надо?
    1. Сложить увеличение объектива и окуляра
    2. Умножить увеличение объектива и окуляра.
    3. Вычесть увеличение объектива из увеличения окуляра
    4. Все вышеуказанное неверно, есть другой способ определения.
  48. Выберите правильный ответ Кипячение — это метод:
    1. Стерилизации
    2. Дезинфекции
    3. Дератизации
    4. Дезинсекции
  49. Выберите правильный ответ. К простым методам окраски бактерий относится:
    1. Окраска одним красителем
    2. Отсутствие окраски
    3. Окраска двумя красителями
    4. Окраска тремя красителями
  50. Выберите правильный ответ. Тинкториальные свойства микроорганизмов:
    1. Восприимчивость к различным красителям
    2. Восприимчивость к различным антибиотикам
    3. Восприимчивость к различным дезинфектантам
    4. Способность расти на питательной среде
  51. Выберите правильный ответ. Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в синий цвет, поскольку:
    1. Имеют споры
    2. Имеют капсулу
    3. Имеют жгутик
    4. Имеют клеточную стенку, содержащую муреин.
  52. Бактерицидное действие химиопрепаратов — это
    1. Полное подавление роста микроорганизмов
    2. Отсутствие подавления роста микроорганизмов
    3. Задержка роста микроорганизмов
    4. Все вышеуказанное неверно.
  53. Бактериостатическое действие химиопрепаратов.
    1. Полное подавление роста микроорганизмов
    2. Отсутствие подавления роста микроорганизмов
    3. Задержка роста микроорганизмов
    4. Все вышеуказанное неверно.
  54. Увеличение сухого объектива равно:
    1. 7
    2. 10
    3. 40
    4. 90

Список литературы

  1. Бакунина Н.А, Краева Э.Л. Микробиология. – М.: Медицина, 1980.
  2. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии: уч.пособие для вузов – М.: Колос, химия, 2004.
  3. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2001.
  4. Воробьева П.И. Техническая микробиология.-М.: МГУ, 1987.
  5. Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология. –М.: Академия, 2003.
  6. Градова Н.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии.- М.: Дели принт, 2004.
  7. Егорова О. В. С микроскопом на «ты». – СПб.: Интермедика, 2000.
  8. Жарикова Г.Г., Козьмина О.А. Микробиология, санитария и гигиена пищевых продуктов.-М.: Гелан, 2001.
  9. Красильников А. П., Романовская Т. Р. Микробиологический словарь-справочник. – Минск: Асар, 1999.
  10. Лабинская А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований.- М.: Медицина, 2004.
  11. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: в 2 т. / Под ред. В. В. Зверева, М. Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010.
  12. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник / под ред. А. А. Воробьева. – М.: ООО «МИА», 2004.
  13. Медицинская микробиология: учебник / под ред. В. Б. Сбойчакова. – СПб.: ВМедА, 2006.
  14. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Общая микробиология.-М.:Академия, 2007.
  15. Промышленная микробиология / Под ред. М.С. Егорова – М.: Высшая школа, 1989.
  16. Сбойчаков В. Б. Санитарная микробиология. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.
  17. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии. – М.: Дрофа, 2004.
  18. Шапиро Л.С. Микроорганизмы. Вирусы. Бактерии. Грибы. – М.: ЭЛБИ, 2003.
  19. Шлегель Г. Общая микробиология: пер. с нем.– М.: Мир, 1987.
  20. ГОСТ Р 51074-97. Продукты пищевые. Информация для потребителя. Общие требования.
  21. СанПиН 2.1.4.1074–01. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества.— 1.01.2002.
  22. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды. Методические указания. 4.2.1018–01.— 1.07.2001.
  23. Санитарно-паразитологические исследования воды хозяйственно-го и питьевого предназначения. 4.2.964–2000.
  24. ГОСТ 18963–73. Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа.
  25. ГОСТ 30425–97. Консервы. Метод определения промышленной стерильности.
  26. ГОСТ 9225–84. Молоко и молочные продукты. Методы микро-биологического анализа.
  27. ГОСТ 30347–97. Молоко и молочные продукты. Методы определения Staphilococcus aureus.
  28. ГОСТ 26809–86. Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу.
  29. МУК 4.2.1018-01. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды / Методические указания.— М.: МЗ РФ, 2001.
  30. МУ № 2.1.7.730–99. Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест / Методические указания.— М.: МЗ РФ, 1999.
  31. ГОСТ 17.4.2.01–81. Охрана природы. Почва. Номенклатура показателей санитарного состояния.