МИКРОБИОЛОГИЯ

В учебном пособии рассмотрены основы морфологии и систематики микроорганизмов, влияние на них факторов внешней среды, пищевые заболевания, вызываемые патогенными организмами. Описаны источники инфицирования пищевых продуктов микроорганизмами, микробиология пищевых продуктов.

Предисловие

Микроорганизмы повсеместно распространены в природе, что является подтверждением их значимой роли в круговороте веществ биосферы и в жизни человека. Со времен седой древности и до наших дней человек использует деятельность микробов в ряде производственных процессов.

Специалисту биологу необходимо знать основы микробиологии, изучающей строение, жизнедеятельность, закономерности роста и развития микроорганизмов, их взаимодействие с внешней средой.

Микроорганизмы широко используются в пищевой промышленности в технологических процессах производства различных продуктов. На основе их жизнедеятельности основано производство кисломолочных продуктов, квашенных овощей, хлеба, вина и пива. От применения микроорганизмов в значительной степени зависят вкусовые качества пищевых продуктов. Микроорганизмы используются в получении многих биологически активных веществ: ферментов, витаминов, антибиотиков.

Однако наряду с полезной микрофлорой существует и группа патогенных микробов − возбудителей болезней человека. Многие из них являются возбудителями порчи различных пищевых продуктов. Микроорганизмы распространенны повсюду, этому способствуют их разнообразные потребности в пище, легкая приспособленность к условиям существования, высокая выносливость, способность к исключительно быстрому размножению.

ТЕМА № 1. Правила работы и устройство микробиологической лаборатории. Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препаратов. Простые и сложные методы окраски

Знание и неукоснительное соблюдение правил работы с различными группами микроорганизмов являются гарантией отсутствия случаев внутрилабораторных заражений, а изучение техники приготовления микроскопических препаратов является основой микроскопического метода исследования.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Ознакомление студентов с устройством микробиологических лабораторий, изучение правил работы в них, освоение техники приготовления и микроскопического исследования окрашенных препаратов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Определение термина «микробиология». Задачи, достижения и проблемы данной научной сферы. Связь микробиологии с другими дисциплинами.
  2. Принципы организации и оборудование микробиологической лаборатории.
  3. Правила работы в микробиологической лаборатории.
  4. Простые и сложные методы окраски бактерий.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Содержать рабочее место в порядке.
  2. Микроскопировать препараты, обнаруживать внутриклеточные включения, капсулы, элементы бактериальной клетки.
  3. Работать с помощью иммерсионного объектива биологического микроскопа, с фазово-контрастной установкой и в темном поле.
  4. Приготовить мазок-препарат, окрашенный простым способом по методам Грама, Циля − Нильсена.
  5. Приготовить препараты для микроскопического исследования микроорганизмов в живом состоянии.

Организация микробиологической лаборатории

Микробиологические лаборатории – это лаборатории, в которых выполняют различные микробиологические исследования. Существуют 3 типа микробиологических лабораторий:

  • клинико-диагностические – при больницах, диспансерах и поликлиниках:
  • санитарно-бактериологические – при санитарно-эпидемиологических станциях (СЭС);
  • ведомственные – при молочных, консервных заводах, мясокомбинатах, хлебозаводах, пивоваренных заводах, водонасосных станциях, станциях защиты растений и др.

Клинико-диагностические лаборатории проводят микробиологическую диагностику инфекционных болезней.

Лаборатории при СЭС осуществляют санитарный надзор на различных предприятиях, следят за санитарным состоянием помещений, оборудования, инвентаря, соблюдением правил личной гигиены персоналом, а на пищевых предприятиях – за соблюдением санитарных правил при технологической обработке, хранении, реализации, транспортировке пищевых продуктов.

Ведомственные лаборатории в зависимости от типа производства выполняют текущие анализы по внутрипроизводственному, входному и выходному контролю на микробную загрязнённость сырья, полуфабрикатов и готовой продукции, занимаются разработкой методов, обеспечивающих микробиологическую безопасность производства.

Выполняя микробиологические исследования, необходимо соблюдать следующие правила:

  • с инфицированным материалом работают только с помощью инструментов (пинцетов, петель, корнцангов и др.);
  • прикасаться руками к исследуемому материалу и конденсату в засеянных чашках запрещается;
  • перед работой тщательно проверяют целость стеклянной посуды, проходимость игл и надежность поршней шприцев;
  • при посеве материала делают надпись на пробирках, чашках Петри, колбах, флаконах с названием номера анализа (культуры) и даты посева;
  • в пробирки и чашки Петри материал высевают вблизи от огня горелки с обжиганием петли, шпателя, краев пробирки;
  • во время работы все чашки с посевами помещают в кюветы или на подносы, пробирки − в штативы;
  • растворы, содержащие патогенные микроорганизмы, набирают пипеткой с помощью резинового баллона;
  • насасывать ртом и переливать растворы из сосуда в сосуд через край нельзя;
  • по окончании работы запрещается оставлять на рабочих столах нефиксированные мазки, чашки Петри, пробирки и другую посуду с инфицированным материалом;
  • не разрешается выходить за пределы лаборатории в халатах и надевать их на верхнюю одежду.

Доставлять инфицированный материал в лабораторию и переносить его из одной лаборатории в другую на территории учреждения нужно в специально приспособленной посуде (металлических биксах, ящиках, баках).

В комнатах, предназначенных для обработки и посева инфекционного материала, нельзя проводить другие работы, выращивать цветы, держать домашних животных.

Принимать пищу, пить, курить, хранить продукты питания в помещениях, в которых работают с материалом, зараженным патогенными микроорганизмами или подозрительным на такое заражение, запрещается.

Центрифугирование инфекционного материала проводит специально обученный персонал. Если в процессе центрифугирования разбивается пробирка, содержащая инфекционный материал, центрифугу отключают от сети, выжидают время для того, чтобы осели капли аэрозоля, дезинфицируют, а загрязненные места очищают.

Термостаты и термостатные комнаты, предназначенные для выращивания патогенных микроорганизмов, дезинфицируют не реже одного раза в месяц.

При хранении инфекционных материалов в холодильнике необходимо принимать меры, предупреждающие его инфицирование. Оттаивание холодильника, предусмотренное правилами эксплуатации, нужно совмещать с его дезинфекцией.

В лаборатории обязательно должна быть укомплектованная аптечка для экстренной медицинской помощи, включающая этиловый спирт, настойку йода, перевязочные средства, набор необходимых антибиотиков.

Использованные при лабораторных исследованиях предметные стекла, пипетки, шпатели погружают на сутки в банки с дезинфицирующим раствором, затем моют и кипятят.

Отработанные чашки Петри и пробирки с посевами культур, посуду с использованным материалом, собирают в банки с крышками и стерилизуют паром под давлением.

Бактерицидные лампы включают только в отсутствие персонала.

Руки тщательно моют с туалетным мылом, вытирают вафельным полотенцем и смазывают защитным питательным кремом.

Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препаратов. Простые и сложные методы окраски

В связи с малыми размерами большинства патогенных микроорганизмов (не более 2-30 мкм) изучение их морфологии возможно только с помощью специальных оптических приборов, получивших название микроскопы (от греч. микрос − малый и скопейн − рассматривать, наблюдать). Они дают значительное увеличение и обладают высокой разрешающей способностью, то есть наименьшим расстоянием между двумя точками, дающими в поле зрения раздельное изображение.

Разрешающая способность человеческого глаза превышает 80 мкм. Размеры патогенных микроорганизмов меньше указанной величины, поэтому мы их не видим. Более того, микроорганизмы, расположенные друг к другу ближе 80 мкм, раздельно не воспринимаются. Современные микроскопы позволяют получать раздельное увеличенное изображение микроорганизмов и других объектов и структур, не доступных невооруженному человеческому глазу.

В настоящее время в практике микробиологических исследований используют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, исследовательский, электронный) и специальные методы микроскопии (темнопольный, фазово-контрастный).

Биологический микроскоп

Для микроскопических исследований применяют биологические микроскопы отечественных моделей: БИОЛАМ Р-11, БИОЛАМ Р-15, БИОЛАМ 17, БИОЛАМ С-11, БИОЛАМ П-1, БИОЛАМ И (микроскопы Р − рабочие, С − студенческие).

Современный биологический микроскоп — сложный оптический прибор, позволяющий изучать объекты в проходящем свете, в светлом и темном поле, а также в отраженном свете. Все эти микроскопы обеспечивают достаточно большое увеличение и высокую разрешающую способность (до 0,4 мкм).

Биологический микроскоп состоит из двух систем − механической и оптической (рис.1).

Механическая система микроскопа включает: штатив; колонку; тубус (съемный, наклонный − в современных моделях); подвижный предметный столик; макрометрический винт для грубой (ориентировочной) настройки на резкость; микрометрический винт, обеспечивающий тонкую фокусировку препарата; револьвер для объективов.

Оптическая система микроскопа содержит две части – осветительную и наблюдательную. Осветительная часть состоит из зеркала и конденсора с ирисовой апертурной диафрагмой. Зеркало имеет две отражательные поверхности – плоскую и вогнутую. С помощью конденсора лучи, идущие от зеркала, фиксируются и направляются на препарат. Яркость освещения регулируется ирисовой диафрагмой.

Устройство микроскопа

Рисунок 1. Устройство микроскопа: 1.окуляр, 2. насадка, 3. штатив, 4. основание, 5. револьверная головка, 6. объективы, 7. координатный столик, 8. предметный столик, 9. конденсор с ирисовой диафрагмой, 10. осветитель 11. переключатель (вкл./выкл.), 12. винт макрометрической (грубой) фокусировки, 13. винт микрометрической (точной) фокусировки

Оптическую часть микроскопа составляют объектив и окуляр. В микроскопах с наклонным тубусом имеется специальная призма, направляющая лучи под углом 450 к вертикали.

Объективы микроскопа отличаются сложным устройством и состоят из нескольких отдельных линз – фронтальной (нижней) линзы, увеличивающей объект, и коррекционных, исправляющих недостатки оптического изображения. Обычно применяют ахроматические объективы, в которых устранена хроматическая аберрация в отношении наиболее ярких цветов спектра (окрашивание изображения в различные цвета благодаря различной преломляемости лучей с различной длиной волны) и сферическая аберрация (нечеткое изображение периферических частей рассматриваемого предмета). Апохроматические объективы дают отчетливое, почти бесцветное изображение, поэтому они особенно эффективны при микрофотографировании (в них достаточно устранен остаточный хроматизм и достигнута равномерность резкости и величины изображения в лучах с разной длиной волны). Подобную оптику имеет БИОЛАМ Р-17 (объективы-апохроматы 10x, 20x, 60x, 90x МИ).

Объективы разделяют на сухие и иммерсионные (от лат. Immersio − погружение). Обычно биологические микроскопы оснащают двумя сухими объективами (8x и 40x) и одним иммерсионным (90x МИ), однако последние модели помимо указанных объективов оснащены более совершенной и разнообразной оптикой (БИОЛАМ Р-17 – апохроматами, БИОЛАМ И – планапохроматами ). Данные о каждом объективе обозначены на его оправе; к ним относятся: а) показатель увеличения x8, x40, x90; б) численная (нумерическая) аппертура; в) заводской номер объектива. Наряду с этими обозначениями иммерсионные объективы x90 (x100 БИОЛАМ И) имеют дополнительный буквенный индекс ОИ или МИ (объектив иммерсионный или микроскоп), а также черную маркировочную линию в нижней части объектива (рис.2).

Ход лучей в объективе с иммерсией

Рисунок 2. Ход лучей в объективе с иммерсией: 1-иммерсионное масло n=1,515; 2- фронтальная линза иммерсионного объектива; 3- предметное стекло n=1,52

Фронтальная линза иммерсионного объектива имеет короткое фокусное расстояние – 1,5-3 мм. При микроскопии ее погружают в каплю предварительно нанесенного на препарат иммерсионного масла, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла – 1,52. При этом устраняются неизбежные потери света при попадании в объектив.

Окуляры состоят из двух линз: верхней − глазной и нижней − собирательной. На оправе окуляров обозначено увеличение: x5 (22 мм), x7 (18 мм), x10 (13 мм), x15 (11 мм). Окуляры подобны лупе и лишь увеличивают изображение, полученное объективом микроскопа.

Общее увеличение микроскопа определяют произведением увеличений объектива и окуляра. Например, увеличение микроскопа с иммерсионным объективом x90 и окуляром x10 составляет: 90 х 10 = 900 раз. Полезное увеличение микроскопа может достигать 1500 раз, в повседневной же практике обычно используют увеличение порядка 630-900 раз.

Для полного использования разрешающей способности микроскопа необходимо хорошо знать его устройство и, прежде всего, правильно осветить исследуемый объект. Освещение объектов может быть осуществлено естественным (дневным) или искусственным светом (БИОЛАМ Р-11, БИОЛАМ Р-15, БИОЛАМ Р-17, БИОЛАМ С-11), во многих моделях микроскопов предусмотрено исследование объектов только при искусственном свете, так как они оснащены встроенным осветителем, в котором источником света являются лампы КГМН 6-30 (БИОЛАМ П-1), КГМ 9-70 (БИОЛАМ И) и КГМ 6-20 (ЕС БИМАМ Р-11, ЕС БИМАМ Р-13, ЕС БИМАМ Р-31). При повседневной работе целесообразно пропускать искусственный свет через матовый светофильтр конденсора.

В настоящее время фирмой «ЛОМО» (Санкт-Петербург) выпускаются так называемые микровизоры (рис. 3), то есть микроскопы, у которых вместо окуляра присутствует цветной телевизор, что дает, во-первых, возможность оцифровывать изображение на компьютере, а во-вторых, просматривать изображение одновременно нескольким лицам.

Микровизор

Рисунок 3. Микровизор

При работе с микроскопами, у которых встроенный источник света отсутствует, рекомендуется использовать следующие приемы в определенной последовательности.

  1. Подготовить микроскоп для работы: взять зеркало с плоской поверхностью (вогнутое зеркало применяют очень редко, как правило, при работе с объективами малых увеличений и без конденсора), конденсор поднять в верхнее положение до упора, диафрагму конденсора полностью открыть, поворотом револьвера включить сухой объектив (40х0,65), поставить матовый светофильтр.
  2. Исследуемый препарат установить на предметном столике и закрепить специальными клеммами.
  3. Повернуть зеркало таким образом, чтобы поле зрения микроскопа было освещено наиболее ярко.
  4. Поднимая или опуская тубус макрометрическим винтом, найти плоскость препарата и при необходимости рассмотреть его под малым увеличением.
  5. Поворотом револьвера включить иммерсионную систему (объектив 90х1,25) и на препарат нанести каплю иммерсионного масла.
  6. Под контролем глаза осторожно погрузить объектив в масло.
  7. Проверить освещенность поля зрения и наклоном зеркала улучшить освещенность препарата.
  8. Вращением макрометрического винта произвести грубую фокусировку изучаемого препарата.
  9. Детали исследуемого объекта рассмотреть, вращая микрометрический винт.
  10. Яркость освещения объекта отрегулировать только диафрагмой конденсора (не рекомендуют с этой целью менять положение конденсора). При смене препаратов операции с первой по пятую повторяют.

При работе со специальными осветителями (типа ОИ-32, ОИ-35 и др.) нужно поступать следующим образом.

  1. Микроскоп подготовить к работе обычным порядком. Зеркало взять с плоской поверхностью.
  2. Осветитель установить перед микроскопом с помощью соединительной планки, прилагаемой к осветителю, или, если ее нет, на расстоянии 20 см от зеркала.
  3. Световой поток направить на зеркало, для чего корпус осветителя необходимо наклонить.
  4. Закрыв диафрагму осветителя и перемещая патрон лампы вдоль оси, добиться четкого изображения ее нити на закрытой диафрагме конденсора.
  5. На предметный столик микроскопа установить и укрепить клеммами препарат.
  6. Открыв диафрагмы конденсора и осветителя при малом или среднем увеличении (объективы х8 или х40), найти оптическую плоскость препарата.
  7. Закрыв диафрагму осветителя и слегка передвигая зеркало, установить изображение диафрагмы осветителя в центр поля зрения микроскопа.
  8. Перемещая конденсор микроскопа по вертикали, получить наиболее четкое изображение границ диафрагмы осветителя. После этого конденсор не подлежит передвижению. Освещение препарата можно уменьшить при помощи диафрагмы конденсора.
  9. Под контролем глаза раскрыть диафрагму осветителя, пока свет не зальет почти полностью поле зрения микроскопа. Дальнейшее раскрытие диафрагмы осветителя не улучшает освещения исследуемого объекта.
  10. На препарат нанести каплю масла, на тубусе установить иммерсионный объектив, отрегулировать освещение исследуемого объекта и приступить к микроскопии.

Точное исполнение изложенных приемов настройки освещения по Келеру является необходимым условием при специальных исследованиях (микрофотографии, установке фазово-контрастного устройства и т. д.).

Иммерсионный микроскоп содержат в чистоте и предохраняют от механических повреждений. При соблюдении этих требований микроскоп может безотказно работать продолжительное время. После работы с объектива обязательно удаляют иммерсионное масло.

Дополнительные приспособления к биологическому микроскопу

Дополнительные приспособления позволяют максимально использовать все возможности биологического микроскопа, облегчают условия работы и значительно расширяют диапазон его применения. В микробиологии наиболее часто применяются следующие приспособления.

  1. темнопольные конденсоры: кардиоид-конденсор и параболоид-конденсор;
  2. фазово-контрастные приспособления: КФ-4 и другие модели;
  3. бинокулярные насадки: АУ-12 и другие модели, которые приближают микроскопию к условиям естественного зрения. Многие модели микроскопов имеют собственные бинокуляры: БИОЛАМ Р-15, БИОЛАМ Р-17, БИОЛАМ П-1;
  4. осветители: ОИ-32, ОИ-35 и другие модели. Источники искусственного света обеспечивают оптимальное и стабильное освещение, интенсивность света в них регулируют реостатом;
  5. микрометры: окуляр-микрометр и объект-микрометр, которые используют для измерения микроскопических объектов;
  6. нагревательный столик, который устанавливают вместо предметного и таким образом обеспечивают постоянную температуру 37 0С; применяют для длительного наблюдения за живыми микроорганизмами;
  7. рисовальный столик, который используют для высококачественной зарисовки препарата; с его помощью можно одновременно видеть изображение объекта и бумаги, расположенной на столе вблизи микроскопа, и обводить на бумаге контуры объекта;
  8. оптические светофильтры: цветные и нейтральные; их устанавливают между источником света и микроскопом и применяют при микрофотографии и специальных методах микроскопии;
  9. микрофотонасадки: МФН-11, МФН-12 и другие модели, их используют для фотографирования микроскопических объектов;
  10. микрокиноустановки, предназначенные для цейтраферной (прерывистой) микросъемки в сочетании с фазово-контрастной микроскопией; они позволяют изучить динамику роста и размножения микроорганизмов, влияние на них разных факторов и многие другие вопросы.

Микроскоп с конденсором темного поля

В микробиологии нашел применение микроскоп с конденсором темного поля. Его используют для повышения контрастности изображения, что имеет большое значение для изучения подвижности бактерий, которые в живом состоянии слабоконтрастны и не видны в обычном микроскопе.

Микроскопия в темном поле основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля − свечение пылинок в воздухе темного помещения, в которое солнечный луч проникает через небольшую щель).

Для создания темного поля в биологическом микроскопе применяют: щелевой метод, затемнение в объективе, специальные конденсоры − параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор, которыми заменяют конденсор в биологическом микроскопе.

Параболоид-конденсор имеет в центре затемнение, задерживающее центральные лучи света, и внутреннюю вогнутую зеркальную поверхность для отражения краевых лучей. В кардиоид-конденсоре лучи вначале отражаются от выпуклой зеркальной поверхности, затем от вогнутой. Краевые лучи, выходящие из темнопольного конденсора, проходят в косом направлении и не попадают в объектив, поэтому поле зрения микроскопа остается темным. В объектив попадают лучи, отраженные от объекта, в связи с чем в поле зрения можно наблюдать характерное изображение – на темном поле зрения ярко светятся микробные клетки и другие частицы, находящиеся в препарате.

В качестве источников света для микроскопа с конденсором темного поля используют сильные осветители (ОИ-32, ОИ-35). Настройку освещения и установку препарата («раздавленная капля») производят, руководствуясь изложенными выше правилами работы с биологическим микроскопом. Рекомендуется употреблять сухие объективы и предметные стекла толщиной 0,8-1,2 мм. Работа с темнопольным конденсором осуществляется в определенной последовательности.

  1. После настройки освещения и установки препарата обычный конденсор заменяют темнопольным.
  2. На верхнюю линзу опущенного конденсора наносят каплю жидкости (кедровое масло, дистиллированную воду), поднимают его вверх до тех пор, пока эта капля не коснется предметного стекла и не распространится по нему.
  3. Вращением макрометрического и микрометрического винтов производят фокусировку изучаемого препарата, при этом в поле зрения должно появиться светлое кольцо с темным пятном посредине.
  4. Поднимают конденсор до появления светлого пятна (если форма светлого пятна или кольца неправильная, значит капля иммерсионной жидкости мала).
  5. Винтами конденсора выводят пятно в центр поля зрения и приступают к исследованию.

При работе с иммерсионными объективами необходимо для уменьшения апертуры объектива внутрь него вложить специальную диафрагму, имеющуюся в наборе конденсора темного поля. При смене объективов конденсор дополнительно настраивают винтами.

Фазово-контрастный микроскоп

Метод фазового контраста позволяет наблюдать слабоконтрастные биологические объекты (микроорганизмы, растительные клетки) в неокрашенном состоянии, получая при этом контрастное их изображение. В отличие от микроскопа с конденсором темного поля, выявляющего лишь контуры объекта, метод фазового контраста позволяет увидеть элементы внутренней структуры рассматриваемого прозрачного объекта.

Известно, что качество микроскопии во многом определяется контрастностью объектов, которые в зависимости от светопоглощения подразделяются на амплитудные и фазовые.

Амплитудные объекты характеризуются различным светопоглощением, поэтому они изменяют амплитуду (интенсивность) проходящего через них света. К амплитудным объектам относятся все окрашенные препараты, которые изображаются с большим или меньшим контрастом.

Фазовые объекты имеют одинаковое светопоглощение на разных участках, но отличаются оптической плотностью. При прохождении света через такие объекты амплитуда его не меняется, а изменяется фаза колебания, что не фиксируется глазом. К фазовым объектам относятся живые неокрашенные микроорганизмы, изображение которых в обычном микроскопе отличается малой контрастностью.

Фазово-контрастный микроскоп дает возможность преобразовывать фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, в амплитудные, в результате чего даже прозрачные микроорганизмы становятся видимыми. Прозрачные биологические объекты при фазово-контрастной микроскопии характеризуются достаточно высокой контрастностью – в зависимости от фазовой пластинки они могут давать темные изображения на более светлом поле (явление положительного фазового контраста) или же светлые изображения на темном поле (явление отрицательного фазового контраста). Тип прибора обычно указан в его паспорте.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное приспособление КФ-4, в комплект которого входят следующие предметы:

  • объективы с фазовым кольцами, изменяющие фазу и уменьшающие амплитуду световой волны. На их оправе обозначен дополнительный индекс «Ф» − Ф х 10, Ф х 20, Ф х 40, Ф х 90;
  • фазовый конденсор с револьвером кольцевых диафрагм для каждого объектива. Индексом «О» обозначено отверстие с ирисовой диафрагмой для наблюдения препарата обычным методом;
  • вспомогательный микроскоп малого увеличения, которым заменяют окуляр при наблюдении за настройкой освещения.

При фазово-контрастной микроскопии используют осветители типов ОИ-32 или ОИ-35.

Для исследования методом фазового контраста готовят влажные препараты типа «раздавленная капля». Для этой цели желательно отбирать тонкие стекла. Для длительного наблюдения покровное стекло по краям закрепляют вазелином.

Последовательность работы с фазово-контрастным устройством следующая.

  1. Заменяют конденсор микроскопа специальным фазово-контрастным конденсором и устанавливают его таким образом, чтобы при подъеме фронтальная линза находилась на уровне предметного столика. Револьвером включают кольцевую диафрагму «О».
  2. Обычные объективы заменяют фазовыми.
  3. Помещают препарат на предметный столик микроскопа.
  4. Макрометрическим винтом добиваются точной фокусировки на плоскость исследуемого препарата.
  5. Устанавливают освещение по правилам Келера, которые изложены выше, после чего в положении осветительной лампы, зеркала и конденсора никаких изменений не допускается.
  6. Вместо окуляра вставляют вспомогательный микроскоп. Перемещая окуляр вспомогательного микроскопа внутри тубуса, получают четкое изображение фазового кольца. В этом положении окуляр фиксируют винтом.
  7. Вращая револьвер конденсора, включают нужную кольцевую диафрагму, в результате чего в окуляре помимо фазового темно-серого кольца объектива появится изображение светлого кольца диафрагмы конденсора.
  8. Вращая центрировочные винты, совмещают светлое кольцо конденсора с темным кольцом объектива.
  9. Вспомогательный микроскоп заменяют окуляром.
  10. При исследовании объекта используют желто-зеленый светофильтр, который входит в комплект фазово-контрастного устройства.

При правильной установке освещения изображение объектов в препарате должно получиться очень контрастным. При смене объективов или препарата необходимо проверить совмещенность кольцевой диафрагмы конденсора с фазовым кольцом объектива.

Люминесцентный микроскоп

Фотолюминесценцией называют свечение объектов, возникающее в результате поглощенной ими лучистой энергии. Вследствие некоторых причин свет люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенный (правило Стокса). Поэтому люминесценцию выгодно возбуждать либо ультрафиолетовыми лучами (30-400 нм), либо сине-фиолетовыми. В обоих случаях возникает люминесценция в цветовой гамме всего или большей части видимого спектра, что дает цветное изображение.

Объект, не дающий явления люминесценции, окрашивают специальными красителями – флюорохромами, после чего нефлюоресцирующие компоненты препарата начинают проявлять явления флюоресценции. Из синтетических флюорохромов наилучшие результаты дают акридин оранжевый, корифосфин, примулин, родамин, ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианат), которые обычно применяют в виде слабых водных растворов. Этот вид люминесценции носит название наведенной, вторичной, в отличие от первичной – собственной флюоресценции, нередко проявляемой витаминами, многими пигментами, некоторыми жировыми веществами и антибиотиками, встречающимися в живых организмах, а также некоторыми продуктами нормального и патологического обмена.

Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: цветным изображением, высокой степенью контрастности светящихся объектов на темном поле, возможностью исследования как прозрачных, так и непрозрачных живых объектов, различных жизненных процессов в динамике их развития, а также возможностью обнаружения и установления локализации отдельных микробов и вирусов.

В настоящее время отечественная промышленность выпускает несколько моделей люминесцентных микроскопов, обеспечивающих исследование объектов путем их освещения в проходящем или отраженном свете в стационарных и полевых условиях: ЛЮМАМ Р-8, МЛД-2, МЛП-01, и ряд моделей для специальных исследований (универсальный исследовательский биологический микроскоп МБИ-15-2). Кроме микроскопа с вмонтированным в него осветителем, работающим на ртутно-кварцевой лампе (ДРШ 250-3, ДРШ 100-2 и другие модели) в комплект прибора входят набор объективов, окуляров и светофильтров, электропульт для питания ртутно-кварцевой лампы, а также специальная переходная втулка фототубуса и втулка фотокамер для установки микрофотонасадки (МФН-11 или МФН-12). Светофильтры, имеющиеся в наборе микроскопа, предназначены для выделения из общего излучения источника света строго определенных участков спектра.

В микробиологии применяют два метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител. Метод флуорохромирования почти не отличается от общеизвестных методов окрашивания анилиновыми красителями, хотя и требует меньше времени (доли минуты). В бактериологии этот метод применяется для диагностики таких инфекционных форм, как туберкулез, дифтерия, гонорея, возвратный тиф и др. Кроме перечисленных, отечественная промышленность выпускает микроскопы других типов и приспособления к ним. Из них следует назвать ультрафиолетовый, поляризационный, интерференционный, анаптральный и стерескопический микроскопы. Последнее слово микроскопической техники − биологические микроскопы нового поколения единой системы «ЕС» с широкопольной оптикой повышенного контраста изображения со встроенным осветителем (лампа КГМ-6-20) и блоком питания. Эти микроскопы (ЕС БИМАМ Р-11, ЕС БИМАМ Р-13, ЕС БИМАМ Р-31) оснащены бинокуляром, столом с координатным перемещением и предназначены для наблюдения объектов в проходящем свете в светлом поле.

Электронный микроскоп

Электронная микроскопия делает возможным исследование объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм), и находит применение для изучения вирусов, бактериофагов, тонкого строения клеток микроорганизмов и других субмикроскопических объектов, а также макромолекулярных структур.

Приготовление препаратов для исследования микроорганизмов в электронном микроскопе имеет ряд особенностей (максимальная очистка исследуемого материала от примесей; малая толщина биологического объекта, не более 0,1 мкм; препараты готовят на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницаемо для электронов; для предохранения объекта от разрушения потоком электронов препарат исследуют в течение минимального времени).

Различают прямые и косвенные методы приготовления препаратов. При прямых методах исследуемый материал наносят на ультратонкую пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую сеточку, содержащую до 100 ячеек в 1 мм. Используют органические или неорганические пленки-подложки из коллодия, формвара, углерода, кварца и др. При электронной микроскопии эти пленки не должны обнаруживать собственной структуры и при этом быть достаточно прочными, чтобы выдержать облучение электронами. В биологических исследованиях применяют коллоидные пленки толщиной порядка 10-20 нм.

Широкое распространение получил метод выращивания различных микроорганизмов непосредственно на коллодиевых пленках, находящихся на поверхности питательной среды, и серийного их исследования в электронном микроскопе.

При косвенном методе на объект наносят тонкий слой какого-либо вещества (коллодий, кварц, углерод, разнообразные пластмассы) и делают отпечаток-реплику структуры его поверхности. Приготовленный таким образом препарат изучают в электронном микроскопе.

Повышение контрастности изображения объектов достигается несколькими методами.

Метод оттенения

На исследуемый объект наносят тонкий слой металла (хром, золото, уран и др.). Оттенение препаратов проводят на специальных установках вакуумного распыления. При оттенении тяжелыми металлами удается значительно повысить контрастность изображения и получить представление о третьем его измерении.

Метод позитивного контрастирования

Препарат обрабатывают химическими веществами, которые специфически соединяются с определенными структурами объекта. Так, например, уранил-ацетат обнаруживает нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды, осмий – липоиды; белки выявляются при обработке солями свинца, фосфорно-молиб-деновой и фосфорно-вольфрамовой кислотами. В результате обработки эти структуры становятся менее проницаемыми для электронов и на экране микроскопа выглядят темными на светлом фоне поля.

Метод негативного контрастирования

Контрастное вещество (например, фосфорно-вольфрамовая кислота при нейтральном значении рН) при обработке препарата не проникает внутрь, а покрывает его поверхность снаружи. Создается эффект негативного контраста – на темном фоне фосфорно-вольфрамовой кислоты, которая задерживает электронные лучи, выявляются светлые структуры более проницаемого для электронов биологического объекта.

Наиболее полные сведения о внутренней организации микроорганизмов можно получить, применяя метод ультратонких срезов.

Исследуемый объект фиксируют, затем обезвоживают в спиртах восходящей концентрации и заливают в полимеризующиеся пластмассы (например, метакрилаты). После полимеризации из блоков с помощью специальных ультра-микротомов готовят ультратонкие срезы толщиной 15-30 нм, контрастируют их и исследуют.

Исследование микроорганизмов в окрашенном состоянии

Окрашенные тела микроорганизмов резко отличаются от общего фона препарата, что позволяет установить: а) ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта; б) степень чистоты выделяемой культуры; в) некоторые морфологические особенности микроорганизмов (форму, размеры, наличие спор, жгутиков, капсул).

Приготовление окрашенного препарата состоит из нескольких последовательных операций: подготовки мазка, высушивания, фиксации, окраски. Для этого используют совершенно чистые обезжиренные стекла. Наиболее простой способ обезжиривания состоит в натирании предметного стекла кусочком сухого мыла, а затем протирании чистой марлей. Капля воды, нанесенная на хорошо подготовленную поверхность, легко расплывается.

При взятии бактериальной культуры поступают следующим образом:

  1. нагревают до покраснения бактериологическую петлю в пламени; петлю держат в правой руке за петледержатель;
  2. берут пробирку с культурой в левую руку так, чтобы видеть поверхность питательной среды; вращательным движением вынимают пробку из пробирки, прижимая ее мизинцем и безымянным пальцем правой руки к ладони;
  3. обжигают край пробирки, осторожно вводят петлю и берут материал;
  4. вынимают петлю, обжигают край пробирки, закрывают ее пробкой (рис. 4).

Техника приготовления мазка

Рисунок 4. Техника приготовления мазка

Если препарат готовят из бактериальной культуры, выращенной на плотной питательной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильного физиологического раствора или стерильной водопроводной воды.

Взятый материал осторожно круговыми движениями распределяют по стеклу ровным тонким слоем, после чего петлю немедленно стерилизуют в пламени. Следует помнить, что в этот период происходит работа с живыми микроорганизмами, поэтому резкие движения могут привести к разбрызгиванию материала и повлечь за собой инфицирование рук и окружающих предметов.

Мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в токе теплого воздуха, держа предметное стекло высоко над пламенем. Нельзя допускать перегрева, так как при этом может нарушиться структура микроорганизмов.

При фиксации мазка микроорганизмы погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла, не смываясь при дальнейшей обработке. Наиболее распространенным способом является фиксация в пламени. Предметное стекло (мазком вверх) троекратно проводят через пламя. При таком способе фиксации сохраняются форма бактерий, споры, зерна волютина, однако способ нельзя применять для мазков крови, мазков-отпечатков из органов, а также при выявлении спор и жгутиков. Для этих целей проводят фиксацию в этиловом спирте (20 мин.), в жидкости Никифорова, состоящей из смеси равных объемов этилового спирта и серного эфира (20 мин.), в холодном ацетоне.

Существуют простые и сложные методы окраски. При применении простых методов используется только одна краска – водный фуксин (1-2 мин.) или метиленовый синий (3-5 мин.). По окончании окрашивания препарат промывают струей воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной, и сушат его на воздухе при комнатной температуре или осторожно промокая фильтровальной бумагой.

Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выявить определенные структуры бактериальной клетки.

Окраска по Граму

Окраску необходимо проводить в следующей последовательности.

  1. Окрасить мазок генцианвиолетом (2 мин., через фильтровальную бумагу).
  2. Бумагу удалить, оставшуюся краску слить.
  3. Окрасить мазок раствором Люголя (1 мин.).
  4. Раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% этанола (30-40 с., осторожно покачивать стекло).
  5. Тщательно смыть спирт водой.
  6. Окрасить водным фуксином (2 мин.).
  7. Промыть водой и высушить.

Все бактерии по отношению к окраске по Граму делятся на грамполо-жительные – темно-фиолетового цвета и грамотрицательные – красного (рис.5). Способность окрашиваться в тот или другой цвет зависит от их химического состава. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют аро-матические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. В результате образуется прочный химический комплекс с белком, генцианвиолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных такой комплекс не образуется. Они легко обесцвечиваются под действием спирта.

Успех окраски зависит от ряда причин и прежде всего от правильности обра-ботки спиртом. При длительном его воздействии краска может быть вымыта и из грамположительных бактерий. В таком случае в ходе дополнительной окрас-ки фуксином они примут красный цвет. Слишком кратковременное действие спирта не позволит выявить грамотрицательные бактерии.

Окраска по Граму. Фиолетовые стафилококки и красные вибрионыОкраска по Граму. Фиолетовые стафилококки и красные вибрионы

Рисунок 5. Окраска по Граму. Фиолетовые стафилококки и красные вибрионы

Реактивы для окраски по Граму

  1. Карболовый генцианвиолет
    • генцианвиолета 1 г
    • кислоты карболовой (фенола) 2 г
    • этанола 96% 10 мл
    • воды дистиллированной 100 мл

Растереть в ступке генцианвиолет с карболовой кислотой, добавляя в начале спирт, а потом воду. Раствор выдержать сутки, профильтровать и использовать для окраски.

  1. Раствор Люголя
    • калия йодида 2 г
    • йода кристаллического 1 г
    • воды дистиллированной 300 мл

В небольшом объеме дистиллированной воды растворить йодистый калий, а затем кристаллический йод, после этого довести объем до 300 мл.

  1. Спирт 96%
  2. Водный фуксин Пфейффера

Приготовление красок

Фуксин готовят в виде концентрированного раствора Циля. Раствор обладает большой стойкостью при хранении. Его применяют при сложных методах окраски (окраска спор, кислотоустойчивых бактерий). Для простого окра-шивания используют фуксин Пфейффера (фуксин Циля, разведенный в 10 раз дистиллированной водой). Он нестоек, и готовят его для работы на один день.

Окраска кислотоустойчивых бактерий

Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной устойчивостью к неорганическим кислотам, спиртам и щелочам. Это связано с наличием в кле-точной стенке и цитоплазме сравнительно большого количества липидов (воскоподобных веществ). Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными красками, поэтому применяют концентрированные растворы красок с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой тела микробных клеток, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии от бактерий, не обладающих этим свойством. Их окрашивают по методу Циля − Нильсена, разработанному с уче-том всех указанных особенностей.

Окраску необходимо проводить в следующей последовательности.

  1. Нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 мин.).
  2. Бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 5% серной кислотой.
  3. Тщательно промыть водой.
  4. Окрасить леффлеровской синькой (3-5 мин.).
  5. Промыть водой и высушить.

Кислотоустойчивые бактерии в результате такой окраски становятся рубиново-красными, а остальные − синими.

  1. Карболовый фуксин Циля
    • Фуксина основного 1 г
    • Спирта 96% 10 мл
    • Кислоты карболовой кристаллической 5 г
    • Воды дистиллированной 100 мл

Растереть в ступке фуксин с карболовой кислотой, спирт добавлять постепенно, а затем небольшими порциями влить дистиллированную воду.

  1. Метиленовая синь по Леффлеру
    • Насыщенного спиртового раствора метиленового синего 30 мл
    • Воды дистиллированной 100 мл
    • % водного раствора КОН 1 мл

Окраска спор

Некоторые виды бактерий образуют внутриклеточные (эндогенные) споры. В отличие от вегетативной клетки они обладают меньшим количеством свобод-ной воды, а также высоким содержанием липидов и кальция.

Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за малой проницаемости оболочки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспри-нимается только вегетативной частью микробной клетки, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее оболочки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при использовании концентрированного раст-вора краски с подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработ-ке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немед-ленно отдают краску.

Окраска спор по методу Ожешко

  1. Нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 мин).
  2. Слить кислоту, промыть водой, высушить.
  3. Зафиксировать в пламени.
  4. Окрасить по методу Циля − Нильсена. При этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы − в синий (рис. 6). Часто для окраски спор используют только метод Циля − Нильсена.

Споры возбудителя столбняка, окрашенные в красный цвет

Рисунок 6. Споры возбудителя столбняка, окрашенные в красный цвет

Окраска включений волютина

Волютин - производное нуклеиновой кислоты - играет роль запасного питательного вещества. Среди включений запасного характера − жиры, гликоген, волютин, который занимает особое место. На основании его присутствия и особого расположения в клетке ставят предварительный диагноз методом бактериоскопии при подозрении на дифтерию. Наиболее демонстративные результаты удается получить при окраске зерен волютина по методу Нейссера.

Методика проведения

  1. Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 мин).
  2. Промыть.
  3. Окрасить раствором Люголя (30 с).
  4. Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 мин).
  5. Промыть препарат и высушить.

Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, воспринимает щелочной краситель везувин и приобретает желтый цвет. Зерна волютина, прочно фиксировавшие ацетат цинка, − темно-синие, почти черные.

Реактивы для окраски по методу Нейссера

  1. Уксуснокислая синька Нейссера
    • метиленового синего 0,1 г
    • спирта 96% 2 мл
    • уксусной кислоты конц. 5 мл
    • воды дистиллированной 100 мл
  2. Везувин
    • везувина 2 г
    • воды дистиллированной 300 мл

Прокипятить приготовленный раствор и, охладив, профильтровать.

Обнаружение капсул у бактерий

Некоторые микробы обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки, его называют капсулой. В состав капсул входят, главным образом, полисахариды, но у некоторых они содержат и полипептиды. Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для их обнаружения применяют негативную окраску. Все перечисленные методы относятся к позитивным, так как при их использовании окрашиваются микроб-ные клетки. При негативных способах краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне.

Методика обнаружения капсул по методу Бурри

  1. Смешать на предметном стекле немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши; приготовить тонкий мазок.
  2. Высушить на воздухе и бактериоскопировать. На темном фоне хорошо видны бесцветные капсулы.

Модификация по Бурри − Гинсу включает создание фона индикатором конго красный, последующую фиксацию в 5% растворе НСl и дополнительную окраску водным фуксином. В результате общий фон − темного цвета, капсулы − бесцветные, а тела бактерий − красные.

Окраска по Романовскому – Гимзе

Относится к сложным методам и применяется чаще всего для мазков-отпечатков из органов или мазков крови после фиксации в жидком фиксаторе. Позволяет выявить ядерные элементы бактериальных клеток и гранулы волютина. Для окраски берут каплю готовой краски на 1 мл воды, которая должна быть подщелочена до рН 7,2.

Методика проведения

  1. Поместить препарат (мазком вниз) в чашку Петри, подложив под края стекла спички или кусочки предметных стекол.
  2. Подлить краску сбоку так, чтобы она без пузырей подтекла под мазок (красить 1-24 ч.).
  3. Промыть водой (рН 7,2) и высушить.

Протоплазма молодых клеток окрашивается в сине-фиолетовый цвет, ядерные элементы – в красно-фиолетовый.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

  1. Какие типы микробиологических лабораторий существуют.
  2. Принципы организации микробиологической учебной лаборатории. Оснащение микробиологической лаборатории и рабочего места. Правила работы и техника безопасности.
  3. Устройство светового микроскопа. Иммерсионная микроскопия.
  4. Темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная и электронная микроскопия и микроскопы (устройства).
  5. Приготовление фиксированных препаратов мазков.
  6. Простые и сложные методы окраски. Механизм и этапы окраски по Граму. Особенности окраски методами Романовского, Ожешко, Бурри − Гинса, Нейссера, Циля − Нильсена.
  7. Приготовление препаратов для изучения микроорганизмов в нативном состоянии. Методы «висячей», «раздавленной» капли. Витальная (прижизненная) окраска.

РАБОТА ПОД РУКОВОДСТВОМ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ

  1. Ознакомление с основными приборами и оборудованием, используемыми в микробиологических лабораториях.
  2. Изучение иммерсионной системы светового микроскопа.
  3. Приготовление фиксированных мазков из бактериальных культур и их окраска простыми методами.
  4. Микроскопия окрашенных препаратов с использованием обычных и иммерсионных систем.
  5. Приготовление фиксированных мазков из бактериальных культур и их окраска сложными методами (по Граму, Цилю – Нильсену, Ожешко, Нейссеру, Бурри – Гинсу).
  6. Приготовление препаратов для изучения бактерий в живом состоянии.
  7. Приготовление мазков «висячей» и «раздавленной» капли.
  8. Приготовление препаратов, окрашенных метиленовым синим.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

  1. Записать основные правила работы в микробиологической лаборатории.
  2. Приготовить нативные мазки «висячей» и «раздавленной » капли.
  3. Приготовить фиксированные препараты из смеси бактериальных культур.
  4. Провести микроскопию и зарисовать микроскопические препараты.

ТЕМА № 2. Морфология бактерий. Ультраструктура бактериальной клетки

Знание морфологии и изучение ультраструктуры бактерий является основой микроскопического метода исследования и необходимо для правильного применения химиотерапевтических препаратов.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Изучение морфологии и ультраструктуры бактерий.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Формы бактериальных клеток и методы изучения морфологических особенностей.
  2. Основные морфологические особенности бактерий.
  3. Основные морфологические типы бактерий.
  4. Элементы ультраструктуры бактериальной клетки.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Дифференцировать бактерии по морфологическим признакам.
  2. Определить родовую принадлежность конкретных бактерий по морфологическим признакам.

Морфология бактерий

По форме клеток бактерии делятся на шаровидные, палочковидные и извитые. Шаровидные бактерии (кокки) имеют сферическую форму и по взаимному расположению клеток после деления различаются:

  • микрококки- клетки расходятся и располагаются одиночно;
  • диплококки- клетки располагаются попарно;
  • стрептококки-кокки делятся в одной плоскости и не расходятся после деления;
  • тетракокки-деление клеток происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях и клетки располагаются по четыре;
  • сарцины (пакеты)- деление происходит в трёх взаимно перпендикулярных плоскостях;
  • скопления кокков, внешне напоминающие виноградную гроздь, называются стафилококками.

Кокки имеют диаметр 1-2 мкм.

Палочковидные бактерии различаются формой клеток, размерами и расположением. Длина их в зависимости от вида микроорганизма колеблется от 0,5 до 8 мкм, а поперечник – от 0,3 до 2 мкм.

Палочки могут быть правильной и неправильной формы, в том числе ветвящиеся, например, у актиномицетов.
По характеру расположения клеток в мазках выделяют:

  • монобактерии – расположены отдельными клетками;
  • диплобактерии – расположены по две клетки;
  • стрептобактериии – после деления образуют цепочки клеток.

Палочковидные бактерии могут образовывать споры: бациллы и клостридии.

Извитые формы бактерий представлены изогнутыми палочками и могут иметь один или несколько витков спирали. Слегка изогнутые палочки называются вибрионами. Они имеют длину 1-3 мкм.

Спириллы- длинные, изогнутые (один или несколько завитков).

Спирохеты длинные, тонкие клетки с большим количеством мелких завитков.

Структура бактериальной клетки

Клетка — универсальная структурная единица живой материи. Организация бактериальной клетки обеспечивает удвоение биомассы за определенный срок за счет размножения посредством бинарного деления.

Элементы ультраструктуры бактериальной клетки

В составе прокариотической клетки выделяют следующие структуры.

  1. Клеточная стенка; по химической структуре клеточной стенки различают грамположительные и грамотрицательные бактерии.
  2. Периплазматическое пространство.
  3. Цитоплазматическая мембрана.
  4. Цитоплазма, нуклеоид, мезосомы (аналог митохондрий у эукариотов), рибосомы, включения;
  5. У некоторых бактерий – капсула, микрокапсула, жгутики, плазмиды, фимбрии (реснички), споры.

Клеточная стенка — важный и обязательный структурный элемент подавляющего большинства прокариотных клеток. На долю клеточной стенки приходится от 5 до 50% сухих веществ клетки. Клеточная стенка служит механическим барьером между протопластом и внешней средой и придает клеткам определенную, присущую им форму.

Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет однородную струк-туру, ковалентно связана с ригидным слоем, содержит небольшие количества липидов, полисахаридов и белков. Она значительно толще, чем у грамотри-цательных бактерий, и достигает 20-60 нм. Основную массу стенки составляют 5-6 слов пептидогликана, с которым ковалентно связаны тейхоевые кислоты. Особенностью пептидогликанов грамположительных бактерий является от-сутствие диаминопимелиновой кислоты.

Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-18 нм. Ригидный слой представлен 1-2 слоями пептидогликана, в котором есть диаминопимелиновая кислота. В составе клеточной стенки содержится много лиопротеинов, фосфолипидов, липополисахаридов, больше белка, но отсутст-вуют тейхоевые кислоты. Пластичный слой клеточной стенки представлен сложной мозаикой из липопротеинов, липополисахаридов и наружной мембра-ны.

Некоторые бактерии имеют пространство (зону) между клеточной стенкой и плазматической мембраной - периплазматическое пространство (периплазма). Толщина периплазмы составляет около 10 нм и может включать до 20% всей находящейся в клетке воды. В ней локализуются некоторые ферменты и транспортные белки - переносчики соответствующих субстратов.

К клеточной оболочке бактериальной клетки тесно прилегает внешний слой цитоплазмы - цитоплазматическая мембрана. Она состоит из двух слоев липидов и встроенных в липидную мембрану белковых молекул. Компоненты цитоплазматической мембраны ( ЦПМ ) составляют около 10% сухого веса бактериальной клетки. Эта полупроницаемая мембрана контролирует транспорт питательных веществ и воды в клетку, а также является физическим барьером между внутренним содержимым бактериальной клетки и внешней средой.

Содержимое тела бактериальной клетки, или ее цитоплазма, представляет собой желеобразный, вязкий раствор, в котором растворены различные органические и неорганические соединения. Бактериальная цитоплазма неподвижна, имеет высокую плотность, содержит мелкие зерна, состоящие из 60% РНК и 40% протеина, представляющие собой рибонуклеопротеиды, получившие название «рибосом». Они выполняют функцию синтеза белка. Цитоплазма большинства бактерий содержит ДНК и запасные гранулы (крахмала, гликогена, жировых веществ), пигментные скопления, сера, кальций.

Нуклеоид, ядерное вещество клетки, ее наследственный аппарат, состоит из двойной нити ДНК, сомкнутой в кольцо и свободно погруженное в цитоплазму, в отличие от эукариот. В молекуле ДНК закодирована генетическая информация клетки.

Мембранные структуры прокариот менее дифференцированы, чем органоиды эукариот. Бактерии имеют лишь аналоги некоторые из них. Например, аналогом митохондрий у прокариот являются мезосомы, которые образуются путём инвагинации цитоплазматической мембраны и содержат ферменты, необходимые для синтеза АТФ.

У бактерий различают микрокапсулу, капсулу и слизистый слой, которые относятся к факторам патогенности. Микрокапсулы выявляются на электрон-ных микрофотографиях в виде коротких мукополисахаридных фибрилл. Капсула (слизистый слой) играет роль внешнего покрова бактерии, защищает от неблагоприятного воздействия факторов внешней среды и обнаруживается под световым микроскопом после окрашивания по методу Бурри − Гинса.

У некоторых видов микробов имеются пили (реснички, фимбрии, филаменты), представляющие собой образования, которые значительно короче и тоньше жгутиков. Они покрывают тело клетки. Полагают, что они не являются органами передвижения, а способствуют прикреплению микробных клеток к поверхности некоторых субстратов.

Жгутики предназначены для передвижения бактерий. Жгутики построены из специального белка –флагелина. Длина его составляет 20 мкм, диаметр 10-20 нм.

По расположению жгутиков подвижные микробы подразделяются на 4 группы (рис. 7):

  • монотрихи — бактерии с одним жгутиком на конце (холерный вибрион);
  • амфитрихи — бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;
  • лофотрихи — бактерии, которые имеют по пучку жгутиков на одном конце (палочки сине-зеленого молока);
  • перитрихи — бактерии, обладающие жгутиками по всей поверхности тела (кишечная палочка).

Жгутикование бактерий

Рисунок 7. Жгутикование бактерий: A — монотрихиальное, B — лофотрихиальное, C — амфитрихиальное,
D — перитрихиальное.

Исследование микроорганизмов в живом состоянии

В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их фор-мы, подвижности или определения прижизненной внутренней структуры. Изучают нативные и окрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли.

Прижизненная (витальная) окраска

Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового си-него или нейтрального красного. Затем готовят препарат «раздавленная» или «висячая» капля и микроскопируют.

Приготовление препарата «раздавленная капля»

На центр обезжиренного предметного стекла наносят каплю жидкой бульонной культуры. Если культура выращивалась на плотной питательной среде, то на стекло наносят каплю стерильного изотонического раствора натрия хлорида, затем петлей прикасаются к культуре и приставшие к ней бактерии размешивают в приготовленной капле. Можно заранее приготовить взвесь микроорганизмов в изотоническом растворе и взять каплю из нее. На исследуемый материал накладывают покровное стекло так, чтобы не было пузырьков воздуха. Каплю надо брать такой величины, чтобы она заполняла все простран-ство между покровным и предметным стеклами и не выступала за края по-кровного. Препарат можно рассматривать как с сухими системами, так и с иммерсионной. Микроскопируют, используя объективы 40х или 90х. Очень хорошие результаты получают, применяя темнопольное или фазово-контрастное устройства. Препараты быстро высыхают, поэтому, если их приходится рассматривать не тотчас, а спустя некоторое время, их помещают во влажную камеру (чашку Петри), на дно которой положено 2-3 влажных кружка фильтро-вальной бумаги, покрытых двумя сухими.

Во избежание высыхания препарата и вызываемого конвекцией турбулент-ного движения жидкости подобные препараты можно герметизировать. Для этой цели следует пользоваться парафиновым маслом, смесью равных частей парафина и вазелина или лаком для ногтей.

В центре влажного препарата быстро возникает недостаточность кислорода. В сущности именно это помогло Пастеру открыть анаэробный обмен: наблюдая за препаратом, он заметил, что облигатные анаэробы сохраняли подвижность только в центре, но не по краям.

Подвижные микроорганизмы иногда могут адсорбироваться на стекле; в та-ких случаях подвижность легче наблюдать в «висячей» капле.

Приготовление препарата «висячая капля»

Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной взвеси. Затем предметное стекло с лункой, края которой пред-варительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки, в результате чего стекла склеиваются. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает. В правильно приготовленном препарате капля свободно висит над лункой, не касаясь ее дна или края (рис.8). Микроскопируют со стороны покровного стекла, причём вначале следует найти край на малом увеличении и при суженной диафраг-ме, используя сухой объектив 8х, затем на большом и продолжить наблюдение.

Препарат висячая капля

Рисунок 8. Препарат висячая капля

При изучении подвижности микроорганизмов необходимо отличать истин-ную подвижность от броуновского движения, которое является следствием ударов о бактерии движущихся в растворе молекул и выявляется в виде коле-баний. Многие подвижные микроорганизмы движутся очень быстро, что за-трудняет точное наблюдение. Добавляя к суспензии микроорганизмов метил-целлюлозу, можно уменьшить скорость их движения и создать условия, при которых движение жгутиков становится видимым.

Недостатком метода является наличие ряда оптических дефектов, связанных с кривизной лунки, что препятствует получению высококачественных микро-фотографий, а также невозможность использования темнопольного и фазово-контрастного устройств из-за большой толщины предметных стекол с лунками.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

  1. Основные принципы классификации микроорганизмов.
  2. Отличия прокариотических и эукариотических клеток.
  3. Морфология бактерий. Спорообразование у микроорганизмов.
  4. Отличия химического состава и строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.
  5. Структура бактериальной клетки и методы выявления ее элементов.
  6. Морфологические особенности кокков, палочек, спирохет и актиномицетов.

РАБОТА ПОД РУКОВОДСТВОМ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ

  1. Приготовление фиксированных мазков из бактериальных культур и их окраска простыми методами.
  2. Микроскопия окрашенных препаратов с использованием обычных и иммерсионных систем.
  3. Приготовление фиксированных мазков из бактериальных культур и их окраска сложными методами (по Граму, Цилю − Нильсену, Ожешко, Нейссеру).
  4. Приготовление мазков «висячей» и «раздавленной» капли.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

  1. Приготовить нативные мазки «висячей» и «раздавленной» капли.
  2. Приготовить фиксированные препараты из исследуемой смеси бактериальных культур.
  3. Окрасить фиксированные мазки метиленовым синим.
  4. Окрасить фиксированные мазки по Граму.
  5. Выявить споры, зерна волютина и кислотоустойчивых бактерий соответствующими методами окраски.
  6. Определить подвижность исследуемых бактерий.
  7. Определить родовую принадлежность бактерий в готовых мазках, окрашенных по Романовскому − Гимзе.

Тема № 3. Физиология, биохимия бактерий. Питательные среды. Этапы выделения и идентификации чистых культур аэробных и анаэробных бактерий

Знание физиологии и биохимических свойств микроорганизмов позволяет провести идентификацию чистых культур бактерий.

Для получения чистых культур микроорганизмов, изучения особенностей их морфологии и физиологии, получения ценных метаболитов, а также для сох-ранения микроорганизмов в виде чистых культур в лабораториях и производ-ственных условиях.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Изучение жизнедеятельности микробных клеток, процессов их питания, дыхания, роста, размножения, а также закономерностей взаимодействия с окружающей средой; ознакомление с типами дыхания и питания микроорга-низмов и техникой приготовления питательных сред, освоение методов выде-ления чистых культур аэробных и анаэробных микроорганизмов, методов иден-тификации чистых культур бактерий.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Особенности питания и дыхания бактерий.
  2. Фазы роста и размножения бактерий в жидкой питательной среде.
  3. Основные питательные среды.
  4. Технику приготовления основных питательных сред.
  5. Получение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.
  6. Методы идентификации бактерий.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Владеть техникой посевов и пересевов бактериальной петлей, иглой, пипеткой и шпателем.
  2. Приготовить питательные среды и определить рН.
  3. Выделить различными методами чистую культуру аэробных и анаэробных бактерий.
  4. Идентифицировать выделенную бактериальную культуру по культуральным и биохимическим свойствам.

Культивирование микроорганизмов в лабораторных условиях

В природе микроорганизмы существуют в смешанной популяции. Для изучения свойств микроорганизмов и определения их систематического по-ложения необходимо прежде всего изолировать отдельные виды микроорга-низмов и вырастить их в виде так называемых «чистых культур», а затем идентифицировать, то есть установить соответствие выделенных микроорга-низмов видам, описанным в специальных определителях.

Под понятием «чистая культура» подразумевается масса клеток, состоящая из микроорганизмов, принадлежащих одному виду и полученных как потомство одной клетки (см. схему 1).

Штамм — культура бактерий одного вида, выделенная из разных источников в разное время.

Вид — совокупность микроорганизмов, имеющих единое происхождение и генотип, сходных по морфологическим и биологическим свойствам.

Культивировать микроорганизмы можно лишь при создании определенных условий для их жизнедеятельности. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри.

Вся посуда и питательные среды должны быть простерилизованы и после посева инокулята (микробного материала, используемого для посева) защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек.

Посев инокулята

Посев инокулята является первым этапом исследования. В практической работе для получения чистых культур микроорганизмов используют одну из модификаций метода высева на чашки со средой. Эти методы основаны на том, что отдельные микроорганизмы иммобилизуются на поверхности или в глубине питательной среды, в которую добавлен агар или какое-нибудь другое гелеобразующее вещество.

Посев петлей (метод истощающего штриха)

Предполагает высев бактериологической петлей из накопительной культуры на поверхность агаризованной среды в чашках Петри. На первом этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов на агаризованной среде (рис. 9, А). Петлю стерилизуют, остужают о незасеянную часть агаризованной среды и проводят серию штрихов в направлении, перпендикулярном первым (рис. 9, Б). Затем петлю вновь стерилизуют, остужают и штрихи наносят в направлении В (рис. 9), а после очередной стерилизации – в направлении Г (рис. 9).

Чашки помещают в термостат и через определенное время учитывают результаты. Обычно на штрихах А и Б вырастает большое число колоний (иногда сплошной рост), тогда как на штрихах В и Г формируются изолированные колонии.

Посев материала петлей на плотную питательную среду

Рисунок 9. Посев материала петлей на плотную питательную среду

Схема 1. Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий

Посев шпателем

Производят в следующей последовательности:

  1. на поверхность питательной среды в чашке № 1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем;
  2. шпатель достают, чашку быстро закрывают и переносят шпатель в чашку № 2, не стерилизуя его. Имитируют распределение культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;
  3. точно те же действия проводят и в чашке № 3, после чего шпатель стерилизуют;
  4. после посева металлический шпатель прокаливают в пламени горелки, а стеклянный помещают в дезинфицирующий раствор.
  5. засеянные чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре.

Через определенное время чашки достают из термостата и изучают рост микроорганизмов. Обычно в чашке № 1 наблюдается сплошной рост бактерий, в последующих чашках формируются изолированные колонии.

Посев тампоном

Тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.

Посев на секторы

Дно чашки расчерчивают на секторы, посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру так, чтобы штрихи с одного сектора не переходили на другой.

Посев газоном

1 мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура или взвесь микро-организмов в физиологическом растворе) наносят пипеткой на поверхность среды и тщательно распределяют жидкость по всей ее поверхности. Избыток материала отсасывают пипеткой и вместе с ней помещают в дезинфицирующий раствор.

После посева чашки закрывают и переворачивают их вверх дном. Надписи на чашках делают со стороны дна, а на пробирках − в верхней части.

При посеве инокулята из пробирки в пробирку обе пробирки (с посевным материалом и со средой) держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцами так, чтобы края пробирок были на одном уровне. Бактериальную петлю держат как авторучку. Петлю вертикально прокаливают в пламени горелки. Пробки из пробирок вынимают правой рукой, зажимая их между мизинцем и ладонью. Вынув пробки, края пробирок обжигают в пламени горелок. Прокаленную петлю вводят через пламя горелки в пробирку с по-севным материалом, охлаждают и, набрав небольшое количество посевного материала, осторожно переносят его в пробирку со средой.

При посеве на жидкую среду петлю слегка погружают в жидкость и расти-рают посевной материал на стенке пробирки, после чего смывают его средой.

Для посева жидкого материала можно использовать стерильные пипетки (пастеровские или градуированные).

При посеве на скошенный агар материал наносят штрихообразными дви-жениями снизу вверх, начиная с конденсационной воды, а если агар или желатин разлит в пробирки столбиком, то посев производят уколом, прокалывая петлей с посевным материалом столбик до дна.

После посева петлю извлекают из пробирки, пробирку закрывают, предва-рительно проведя ее края через пламя горелки. Петлю прокаливают.

При выделении чистых культур аэробов можно использовать не только ме-тоды, основанные на механическом разобщении бактерий, но и методы, осно-ванные на различиях бактерий по биологическим свойствам. Так, например, некоторые подвижные бактерии могут быстро распространяться по слегка влажной поверхности питательной среды, благодаря этому можно очистить их от неподвижных видов микробов.

Иногда при выделении микроорганизмов из природных популяций полезно включить в среду вещества, избирательно подавляющие рост тех или иных микробов. Например, добавление полиеновых антибиотиков (нистатина) в среду используется для очистки бактериальных культур, сильно загрязненных гри-бами.

Посевы инкубируются в термостате 18-24 ч. В течение этого времени из отдельных микробных клеток формируются изолированные колонии.

Колония — это популяция микробных клеток одного вида, сформировав-шаяся в результате деления одной микробной клетки в условиях культивиро-вания на плотной питательной среде при оптимальной температуре.

Изучение изолированных колоний и отвивка чистых культур

Изучение изолированных колоний составляет второй этап исследования. Строение колоний является важным культуральным признаком при определе-нии вида микроорганизмов, так как каждому виду микробов при росте на опре-деленной плотной питательной среде присуща типичная форма колонии.

Колонии изучают невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете и с помощью лупы или под микроскопом при малом увеличении.

При описании колоний учитывают следующие признаки:

  • форму колонии - округлая, амебовидная, ризоидная , неправильная и т.д.;
  • размер (диаметр) колонии - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре);
  • поверхность колонии - гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;
  • профиль колонии - плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т.д.;
  • прозрачность - тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая;
  • цвет колонии (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием;
  • край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т.д.;
  • структура колонии - однородная, мелко или крупнозернистая, струйчатая;
  • консистенция колонии - определяют прикасаясь к поверхности петлей, колония может быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей).

Важно определить тип колонии. Различают два основных типа колоний бактериальной культуры:

  1. колонии гладкие – S-тип (от англ. Smooth − гладкий), характеризующийся круглой и выпуклой формой, гладкой поверхностью, влажной консистенцией;
  2. колонии шероховатые – R-тип (от англ. Rough − шероховатый), характеризующийся шероховатой поверхностью, неправильными краями, сухой консистенцией. Образуются из гладких S-форм в результате мутации.

Помимо этих двух основных типов колоний существует так называемый слизистый М-тип (от лат. Mucus − слизистый), характеризующийся тягучей слизистой консистенцией. Образуется в процессе диссоциации бактериальных культур. Основные формы колоний представлены на рисунке 10.

Основные формы колоний

Рисунок 10. Основные формы колоний: 1- круглая, 2-круглая с фестончатым краем, круглая с валиком по краю, 4,5-ризоидная, 6-крупная с ризоидным краем, 7-амёбовидная, 8-нитчатая, 9-складчатая, 10-неправильная, 11-концентрическая, 12-сложная.

Описание роста микроорганизмов при посеве штрихом включает его особенности: скудный, умеренный, обильный; сплошной с ровным или волнистым краем; диффузный; перистый; ризоидный; древовидный. Характеризуют цвет, поверхность, консистенцию.

Часть изученной колонии берут для приготовления мазка, который окра-шивают и микроскопируют. Если при микроскопии подтверждается однородность состава колонии, то оставшуюся ее часть отвивают на скошенный агар для накопления чистой культуры.

В жидких питательных средах при росте микроорганизмов наблюдается помутнение среды, образование пленки или осадка.

  • Рост бактерий с равномерным помутнением среды характерно для факультативных анаэробов. Степень помутнения может быть слабая, умеренная, сильная.
  • Придонный рост бактерий характеризуется образованием осадка: скудного, обильного, рыхлого, слизистого, хлопьевидного, зернистого. Питательная среда может быть прозрачной или мутной.
  • Пристеночный рост - образование зерен, рыхлых хлопьев на внутренней поверхности стенок сосуда. Питательная среда при этом остается прозрачной.
  • Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности среды пленки: тонкой, плотной, рыхлой, гладкой, складчатой, влажной, сухой, кольцеобразной, сплошной. Такой рост наблюдается при культивировании аэробных бактерий.

Изучение биохимических свойств выделенных микроорганизмов

Биохимические свойства выделенных микроорганизмов изучают на третьем этапе. Культуру микроорганизмов, выросшую на скошенном агаре, проверяют на чистоту путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. При микроско-пии обращают внимание на форму микроба, величину, расположение клетки. Специальными окрасками выявляют споры, капсулы, включения и жгутики.

Для идентификации культур, то есть установления вида и типа бактерий, помимо морфологических и культуральных признаков изучают биохимические, антигенные и другие свойства.

Определение протеолитических свойств микробов

Действие протеолитических ферментов, то есть способность микроорга-низмов расщеплять белки, изучают на средах с желатином, молоком, сы-вороткой, пептоном. Мясо-пептонную желатину (МПЖ) готовят следующим образом: к 100 мл мясо-пептонного бульона (МПБ) добавляют 10-15 г желатины, оставляют на 20-30 мин, чтобы желатина набухла, затем смесь нагревают на водяной бане до полного растворения желатины и разливают полученную МПЖ в пробирки по 8-10 мл. Стерилизуют при 0,5 атм 15 мин. Посев проводят уколом. Продолжительность культивирования 7-10 суток при комнатной температуре. Разжижение желатины или его отсутствие отмечают визуально. Если желатина разжижается, указывают интенсивность и форму разжижения (рис. 11).

Схема разжижения желатины микроорганизмами при посеве уколом

Рисунок 11. Схема разжижения желатины микроорганизмами при посеве уколом: а – кратеровидное; б – реповидное; в – воронковидное; г – мешковидное; д – послойное; е – пузыревидное (а, б, в и д – разжижение вызвано аэробами; г – факультативными анаэробами; е – анаэробами)

Действие микроорганизмов, разлагающих казеин (молочный белок), проявляется в пептонизации (просветлении) молока, которое приобретает вид молочной сыворотки.

В процессе ферментации пептонов микроорганизмами образуются индол (C8Н7N), сероводород (Н2S), аммиак (NH3) и другие соединения.

Для обнаружения сероводорода в пробирку с МПБ после посева исследуемой культуры под пробку помещают узкую полоску фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца: ацетата свинца Рb(CH3COO)2 − 30 г; гидрокарбоната натрия NaHCO3 − 1г; дистиллированной воды − 100 мл. При наличии сероводорода индикаторная бумага чернеет вследствие образования сульфида свинца (II) PbS.

Для выявления индола используют индикаторную бумажку, пропитанную горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты C2H2O4. В присутствии индола бумага становится красной. Определение индола можно провести и с помощью реактива Эрлиха, который состоит из п-N,N’-диметиламинобензаль-дегида − 5 г, очищенной концентрированной ортофосфорной кислоты Н34 10 мл и 96% этилового спирта − 50 мл. К 48-часовой бульонной культуре прибавляют 1-2 мл серного (диэтилового) эфира, основательно встряхивают и затем прибавляют по стенке пробирки 4-5 капель реактива Эрлиха. Через 1-2 мин. появляется ярко-малиновое кольцо в нижней части эфирного слоя, которое свидетельствует о наличии индола.

Аммиак определяют при помощи увлажненной красной лакмусовой бумажки. В присутствии аммиака бумажка синеет.

Определение сахаролитических свойств микробов

Способность микроорганизмов разлагать сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты, а иногда и газа изучают на средах Гисса. В состав этих сред входят пептонная вода, углевод (моносахариды − глюкоза, ксилоза, араби-ноза; полисахариды − крахмал, гликоген), многоатомные спирты (глицерин, маннит, сорбит, инозит) и индикатор. Под действием образующейся при разло-жении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды. Газообразование определяется по наличию пузырьков газа в толщине полужидких сред или, если среда жидкая, в поплавке (стеклянная трубочка, верхний конец которой запаян).

Сахаролитические свойства изучают и на средах Эндо, Левина, Плоскирева. В состав этих сред входит молочный сахар − лактоза, и если микроорганизмы разлагают его до кислоты, то цвет колонии изменяется соответственно инди-катору, находящемуся в среде.

Определение ферментов микробов

Биохимическая активность микроорганизмов обусловлена их ферментатив-ной деятельностью. Ферменты микроорганизмов являются биологическими катализаторами, определяющими метаболические процессы, протекающие в микробных клетках. Разные виды микроорганизмов нередко отличаются по набору ферментов, которые они способны синтезировать.

Каталаза − это фермент, катализирующий разложение перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталаза содержится у аэробов факультатив-ных анаэробов, но не содержится у облигатных анаэробов. Обнаружить ката-лазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1% раствором перекиси. На предметное стекло помещают каплю перекиси водорода и суспензируют в ней небольшое количество микробной культуры, выращенной на плотной среде.

Определение оксидазы - проводят несколькими методами, например: на поверхность фильтровальной бумаги наносят несколько капель 1% водного раствора диметилпарафенилендиамина, снимают запаянным изогнутыи концом Пастеровской пипеткой часть суточной агаровой культуры и растирают ее по поверхности фильтровальной бумаги, обработанной реактивом. Фильтровальная бумага через 1мин окрасится в красный цвет-культура обладает оксидазной активностью (оксидазоположительная); для оксидазоотрицательные культур характерно синее окрашивание фильтровальной бумаги.

Реактив Ковача

Диффузный метод определения ферментов − экспресс-метод может быть использован для поиска активных продуцентов ферментов в природных популяциях микроорганизмов.

Принцип метода

Горячий 3%-ый раствор агара-агара смешивают с равным объёмом раствора субстрата, перемешивают и разливают в чашки Петри. После застывания агара в нем делают лунки, в которые вносят раствор фермента, например, культуральную жидкость, испытуемого микроорганизма. Чашки выдерживают 18 часов при 37 0С, затем выявляют и измеряют зоны превращения субстрата.

Обнаружение амилазы

Субстрат: 1,6 % раствор крахмала кипятят 3 минуты при перемешивании. Полученный раствор смешивают равным объёмом ацетатного буфера рН 5,0, содержащего NaCl (0,4 М буфер и 0,4 М раствор NaCl в равных объёмах).

Окрашивание раствором Люголя 1 мин.

Обнаружение липаз

Субстраты: 0,2 М фосфатный буфер рН 7,6 смешивают с равным объёмом горячего агар-агара, добавляют 0,1% подсолнечного масла, перемешивают 1 минуту в гомогенизаторе и разливают в чашки. Об активности ферментов судят по образованию зоны просветления вокруг лунки.

Особенности культивирования облигатно-анаэробных бактерий

Облигатными анаэробами называют микроорганизмы, обладающие фер-ментативным метаболизмом и не растущие на поверхности аэрируемой питательной среды.

В зависимости от отношения к свободному кислороду облигатные анаэробы делят на умеренные и строгие. Большинство значимых анаэробов (клостридии, бактероиды, фузобактерии, пептококки и др.) относятся к категории умеренных. Они толерантны к кислороду в течение нескольких десятков минут и не растут при его концентрации в среде более 3 %. Строгие анаэробы (метанобактерии и др.) чрезвычайно чувствительны к токсическому действию кислорода и не рас-тут при его содержании в среде более 0,5 %.

Биологические особенности облигатных анаэробов обусловливают необхо-димость применения специальных методов культивирования, отличающихся от используемых при работе с аэробными и факультативно-анаэробными микро-организмами.

Важным условием, которое необходимо соблюдать на всех этапах выделения и идентификации анаэробов, является защита этих микроорганизмов от ток-сического действия молекулярного кислорода. Время между взятием материала и его посевом на питательные среды должно быть максимально коротким. Для защиты содержащихся в патологическом материале облигатных анаэробов от воздействия атмосферного кислорода используют специальные транспортные среды.

Анаэробные бактерии можно культивировать только на специальных бес-кислородных питательных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом (-10 - 150 мв). Для контроля за степенью насыщения этих сред кислородом используют специальные редокс-индикаторы (метиленовый синий, резазурин), восстановленные формы которых бесцветны. При возрастании окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) метиленовый синий окра-шивает среды в синий, а резазурин − в розовый цвет, что указывает на непри-годность таких питательных сред для культивирования облигатных анаэробов.

Для сохранения низкого ОВП питательные среды должны быть агаризованы. Добавление даже 0,05 % агара повышает их вязкость и уменьшает ее аэрацию. Для получения роста облигатно-анаэробных бактерий плотные питательные среды должны быть свежеприготовленными (не более 2 ч. после приготовле-ния) или прередуцированными (выдержаны в анаэростате не менее суток). Для успешного выращивания анаэробов требуется внесение большого количества посевного материала. Это связано с тем, что большие концентрации облигатных анаэробов способны быстрее уменьшать ОВП среды и тем самым создавать бла-гоприятные условия для своего роста.

Анаэробный тип дыхания во много раз менее продуктивный, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть значительно богаче пи-тательными субстратами и витаминами. В качестве питательной основы они со-держат различные экстракты и белковые гидролизаты (сердечно-мозговой и пе-ченочный настои, дрожжевой и соевый экстракты, пептон, триптон, гидролити-ческий перевар казеина и др.), факторы роста (гемин, менадион, твин-80, сук-цинат натрия и др.), цельную или лизированную кровь. Для выделения различ-ных анаэробов из смеси культур к питательным основам добавляют желчь, азид натрия, антибиотики, налидиксовую кислоту, малахитовый зеленый и другие ингредиенты. В практических лабораториях для выделения анаэробов из пато-логического материала чаще всего используют среду для контроля стериль-ности (СКС), среду Китта − Тароцции, анаэробный кровяной агар (на основе эритрит-агара или агара Д), среду Вильсона − Блера и некоторые другие с соот-ветствующими добавками.

Методы создания анаэробных условий

Необходимым условием культивирования анаэробных бактерий является соз-дание анаэробных условий, что достигается с помощью физических, химичес-ких, биологических и смешанных методов.

Физические методы
  1. Для того, чтобы удалить растворенный в питательных средах кислород, производят их регенерацию путем кипячения в течение 15-20 мин. на водяной бане с последующим быстрым охлаждением до 45-50 оС. После посева для предотвращения проникновения кислорода в жидкую пи-тательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.
  2. Посев содержащего анаэробы патологического материала в высокий стол-бик плотной или полужидкой питательной среды, которая разливается в про-бирки в объеме 10-12 мл. Кислород воздуха диффундирует обычно на рассто-яние 1,5-2,0 см от поверхности, а в глубине создаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.
  3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воздуха из герметически закрытых сосудов (анаэростатов, анаэробных боксов) с помощью вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (аргон, гелий) или бескислородной газовой смесью, состоящей из 80 % азота, 10 % оксида уг-лерода IVи 10 % водорода. В ряде случаев используют природный (магистраль-ный) газ. Для поглощения остатков кислорода из газовой смеси используют пал-ладиевый катализатор. Для поглощения водяных паров на дно анаэростата (рис.12) помещают 5-6 г безводного хлорида кальция, 10-12 г силикагеля.

Анаэростат, нержавеющая сталь, Вмещаемое коли       10 (60 до 100 мм диам.)      , Внутр. диаметр 120 ммАнаэростат

Рисунок 12. Анаэростат

Химические методы
  1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде. Для поглощения кислорода из 220 мл воздуха применяют смесь, состоящую из 1 мл 20% раствора пирогаллола и 1 мл насы-щенного раствора карбоната натрия Nа2CO3.
  2. Для поглощения кислорода из замкнутого пространства можно применять гидросульфит натрия. Для связывания кислорода в 1 л объема берут 100 мл свежеприготовленного 20% раствора Na2S2O4 и 16 мл 50% KOH. Эти реагенты связывают кислород быстрее, чем пирогаллол.
  3. Для связывания остатков кислорода в предназначенных для роста ана-эробов питательных средах используют вещества-редуценты, к которым от-носятся тиогликолевая кислота или тиогликолят натрия (0,01-0,02%), аскор-биновая кислота (0,1%), различные сахара (0,1-3%), цистин и цистеин (0,03-0,05%), формиат натрия (0,25-0,75%) и др.
  4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газо-непроницаемых пластиковых пакетах).

С целью образования водорода и оксида углерода (IV), необходимых для рос-та облигатных анаэробов, используют специальные таблетки, которые активи-руются добавлением воды. Водород, генерируемый таблетками боргидрида нат-рия, связывает кислород воздуха в присутствии палладиевого катализатора с об-разованием воды. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с гидрокарбонатом натрия.

Биологические методы
  1. Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). При этом на одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают иссле-дуемый материал, а на другую − культуру аэробного или факультативно-анаэ-робного микроорганизма, способного энергично поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой, края которой для герметизации заливают парафином или заклеивают пластилином. В качестве активного поглотителя кислорода из замкнутого пространства часто используют культуру «чудесной палочки» (Serratia marcescens), которая является своеобразным индикатором качества анаэробиоза. При недостаточной герметизации чашки этот микроор-ганизм образует ярко-красный пигмент, а при сохранении строго анаэробных условий вырастают бесцветные или бледно-розовые колонии.
  2. Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Примером питательной среды, сконструированной по этому принципу, является содержащая кусочки печени среда Китта − Тароцци. К тому же в пе-ченочной ткани содержится большое количество веществ с SH-группой (цис-теин, глютатион и др.), обладающих сильным редуцирующим действием.
  3. Культуры некоторых облигатных анаэробов можно поддерживать путем пассажа на лабораторных животных, однако в настоящее время этот метод используется достаточно редко.

В большинстве практических лабораторий используют смешанные методы создания анаэробных условий. Для работы с наиболее чувствительными к мо-лекулярному кислороду анаэробами используют строгую анаэробную технику. Принцип метода заключается в использовании лишенных кислорода пита-тельных сред, воздух над которыми удаляется и замещается бескислородным газом.

Для предотвращения попадания кислорода сосуды с питательными средами закрываются резиновыми пробками. Во время инокуляции анаэробиоз поддер-живается за счет постоянного омывания сред потоком бескислородного газа.

Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов

Метод Цейсслера

Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной пита-тельной среды, помещают в анаэробные условия и выдерживают в термостате при 37 оС в течение 24-72 ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают в среду для контроля стерильности (СКС) или среду Китта − Тароцции.

Метод Вейнберга

Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл изо-тонического раствора хлористого натрия, перемешивают запаянным капил-ляром и переносят в пробирку с охлажденным до 45-50 оС сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро ох-лаждают под струей холодной воды. Выросшие через 24-72 ч. в глубине агара изолированные колонии анаэробов засевают в среду Китта − Тароцци или СКС.

Метод Вейона − Виньяля

Готовят разведения исследуемого материала в пробирках с сахарным агаром, как указано выше. Из каждой пробирки разведенный материал насасывают в пастеровские пипетки, после чего запаивают их концы. После получения микро-бного роста пипетку надпиливают в соответствующем месте, разламывают с соблюдением правил стерильности и переносят изолированную колонию в среду Китта − Тароцции или СКС.

Метод Перетца

Готовят разведения исследуемого материала как указано выше. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выливают в стерильную чашку Пет-ри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках лежит стек-лянная пластинка размером 6х6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она полностью заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри. При появлении микробного роста стеклянную пластинку удаляют, а изолиро-ванную колонию засевают в пробирку со средой Китта − Тароцции или СКС для получения чистой культуры.

Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод «перевернутых чашек». При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафи-ном. Термостатируют при 37 оС до появления изолированных колоний анаэро-бов.

Питательные среды для выделения и идентификации анаэробов

Анаэробный кровяной агар

Готовится на основе эритрит-агара. В качестве добавок используют среду 199 (10%), гемин (10 мкг/мл), твин-80 (0,1%), менадион (10 мкг/мл), цитратную кровь (5%) и некоторые другие. После приготовления и стерилизации разлива-ют в чашки Петри. Для посева используют свежеразлитые (не позднее чем 1,5-2 ч. после приготовления) или прередуцированные (не менее суток выдержанные в анаэробных условиях) среды.

Анаэробный кровяной агар с селективными добавками

Для подавления роста факультативно-анаэробных бактерий в питательную среду добавляют один из следующих антимикробных препаратов: неомицин или канамицин (75-80 мкг/мл), гентамицин (50 мкг/мл), налидиксовую кислоту (40 мкг/мл). Вместо этих добавок на поверхность засеянной питательной среды можно накладывать по 2-4 диска с канамицином (по 1000 мкг в диске).

Желточный агар

В питательную среду на основе эритрит-агара добавляют гемин (10 мкг/мл), глюкозу(0,2%), суспензию яичного желтка (20%) и некоторые другие ингреди-енты. Разливают в чашки Петри, используют для обнаружения лецитовителлаз-ной и липазной активности анаэробных бактерий. При наличии фермента ле-цитиназы (продуцировании альфа-токсина C.perfringens) вокруг выросших на чашке колоний микроорганизмов образуются зоны помутнения (преципитата), а при наличии липазы − зоны радужной блестящей опалесценции, видимой при косом освещении.

Среда для контроля стерильности (СКС)

Это коммерческая питательная среда. Используется как транспортная и как среда накопления. Может применяться с селективными добавками (см. выше). Разливается в пробирки «высоким столбиком». Для обогащения питательной среды дополнительными факторами роста используют среду 199 (10%), гемин (10 мкг/мл), твин-80 (0,1%), менадион (10 мкг/мл) и некоторые другие.

Среда Китта − Тароцции

Готовится на основе бульона Хоттингера с добавлением кусочков печени или мяса и разливается по пробиркам. Используется в качестве среды накопления. После посева патологического материала поверхность питательной среды зали-вают небольшим слоем вазелинового масла или расплавленного парафина.

Среда Вильсона − Блера

Готовится на основе сахарного агара с добавлением сернистокислого натрия (1%) и хлорного железа (0,08%), разливается по пробиркам «высоким столби-ком». Используется для ускоренной диагностики газовой гангрены. При нали-чии в исследуемом материале C.perfringens через 4-6 ч. инкубации при темпе-ратуре 42 оС среда чернеет, и в ней появляются множественные разрывы агара.

Среды для определения редуцирующей способности.

В эту группу входят среды с красками, обесцвечивающимися при восстановлении (например, метиленовый голубой, нейтральный красный, индигокармйн), а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий (при положительном результате среды окрашиваются в синий цвет). Примером такой среды является лакмусовое молоко.

Лакмусовое молоко

Готовится на основе свежего снятого молока с добавлением лакмусовой нас-тойки, разливается в пробирки «высоким столбиком». Используется для уско-ренной анаэробных палочек (например, клостридий). При наличии в исследуемом материале C.perfringens через 2-4 ч. инкубации при температуре 42 оС в среде появляется кирпично-красный, пронизанный пузырьками газа творожистый осадок казеина и прозрачная сыворотка.

Сахарный агар

Готовится на основе эритрит-агара с добавлением 1% глюкозы. Разливают в пробирки по 10-15 мл. Используется для выделения анаэробов по методам Вейнберга, Вейона − Виньяля, Перетца.

Среды для определения сахаролитических свойств анаэробов

Содержат 0,5 % мясо-пептонного агара, 1 % испытуемых углеводов и инди-катор рН. Разливаются в пробирки «высоким столбиком», не требуют добавления вазелинового масла.

Краткая характеристика питательных сред

Питательные среды содержат различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микро-организмов в лабораторных или промышленных условиях. Питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые ката-лизируют метаболические процессы микробной клетки. Сухие питательные сре-ды получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их при-готовления используют непищевое сырье. По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными.

Категории питательных сред по назначению

На универсальных (основных) средах хорошо растут многие виды пато-генных и непатогенных бактерий. К ним относятся МПБ, МПА.

Элективные (селективные) среды предназначены для избирательного рос-та определенных микроорганизмов. Селективные среды позволяют направ-ленно отбирать из исследуемого материала определенные виды бактерий. К ним относятся среда Мюллера, селенитовая, Раппопорт.

Дифференциально-диагностические среды применяют для изучения био-химических свойств. Эти среды позволяют отличать одни виды бактерий от других по характеру их ферментативной активности или культуральным про-явлениям. К ним относятся среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса и др.

Общие требования к питательным средам

Питательные среды предназначены для накопления, выделения, изучения и сохранения микроорганизмов. По своей сущности питательные среды являются искусственной средой обитания микробов, поэтому при их составлении учиты-вают как потребности микроорганизмов в веществах, необходимых для жизни, так и физико-химические условия, в которых микроорганизмы могут осуществ-лять обмен между клеткой и средой.

Для обеспечения разнообразных типов метаболизма микроорганизмов пита-тельные среды должны соответствовать следующим требованиям.

  1. Среда должна содержать все элементы, из которых строится клетка: макро-элементы (углерод, азот, кислород, сера, фосфор, калий, кальций, магний, же-лезо) и микроэлементы (марганец, молибден, цинк, медь, кобальт, никель, вана-дий, хлор, натрий, кремний, и др.). Все элементы должны находиться в удобо-усвояемых конкретным микроорганизмом соединениях. Источником углерода могут быть разнообразные органические соединения: углеводы, многоатомные спирты, органические кислоты, аминокислоты, белки и др. Источником азота служат аммонийные соединения, аминокислоты, пептиды, белки. Источником остальных макроэлементов являются неорганические соединения − соли ортофосфорной и других кислот. Микроэлементы поступают в питательную среду с органическими субстратами, солями и водой. Витамины (особенно группы В) и другие факторы роста вносят в среду в составе органических субстратов или в виде чистых веществ.
  2. Среда должна иметь достаточную влажность (не менее 20 % воды).
  3. Концентрация солей в среде должна обеспечивать изотонию, то есть соот-ветствовать концентрации солей в микробной клетке (для большинства микро-организмов − 0,5 %; для галофильных − 3 %).
  4. Концентрация водородных ионов (рН) среды должна быть оптимальной для выращиваемого микроорганизма (диапазон рН 4,5-8,5).
  5. Окислительно-восстановительный потенциал (Еh) среды должен соответ-ствовать потребностям микроорганизма: для анаэробов − 0,120-0,060 В, для аэ-робов − более 0,080 В.
  6. Питательная среда должна быть стерильной.

Типы питательных сред

По составу питательные среды могут быть синтетическими и натуральными. Питательные среды являются синтетическими, если содержат только химически чистые соединения в установленных дозировках, то есть состав их полностью известен. Достоинством таких сред являются стандартность и воспроизводи-мость. Однако только для немногих патогенных бактерий имеются синтетичес-кие среды. Их применяют главным образом для экспериментального изучения метаболизма микробов.

Для практических исследований широко используют натуральные среды. Натуральные (естественные) питательные среды состоят из продуктов живот-ного и растительного происхождения и имеют неопределенный химический состав.

Различают питательные среды общего назначения (универсальные) и специ-альные питательные среды. Питательные среды общего назначения пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и применяются в качестве ос-новы для приготовления специальных питательных сред. К ним относятся, например, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, бульон Хоттингера, агар Хоттингера и другие. Специальные питательные среды предназначены для избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, изуче-ния их свойств и хранения.

Различают следующие виды специальных сред: элективные (избирательные), дифференциально-диагностические, консервирующие. Избирательность пита-тельной среды для определенных видов микробов достигается путем создания оптимальных для них условий (учитываются рН, Еh, концентрация солей, сос-тав питательных веществ), то есть положительной селекцией, или путем добав-ления в среду веществ, угнетающих другие микробы (желчь, азид натрия, теллурит калия, антибиотики и др.), то есть отрицательной селекцией. Дифференцирующие свойства питательной среды создаются внесением суб-страта, к которому определяется отношение микроба (например, сахаров, ами-нокислот и др.), внесением соответствующих индикаторов (например, рН-индикаторов бромтимолблау, фуксина; Еh-индикаторов).

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими (0,2-0,7 % агара) и плотными (1,5-2 % агара). Сухие питательные среды, вы-пускаемые промышленностью, представляют собой форму консервации сред.

Для обеспечения микрообъемной технологии биохимической идентификации микроорганизмов выпускаются коммерческие микротест-системы. Они пред-ставлены двумя группами, различающимися особенностями содержания суб-страта реакции: первая − в питательной среде; вторая − в шаблоне-носителе. Тест-системы первой группы в микрообъемных лунках полистироловых плас-тин содержат дегидрированные питательные среды, стабилизированные поливиниловым спиртом, например, API-20E, Enterotest 1 и 2, отечественные ПБДЕ и MMTE 1 и Е 2. Тест-системы второй группы имеют субстрат и инди-катор в бумажном или полимерном шаблоне-носителе, например, Micro-ID, Minitek. Разработаны также тест-системы на основе жидких дифференциальных сред, которые можно изготавливать непосредственно в лабораториях. По ре-зультатам биохимических тестов устанавливается вид микроорганизма. Это де-лается с помощью таблиц идентификации, аналитического каталога кодов или приборов автоматизированных микробиологических систем биохимической идентификации микроорганизмов.

В силу способности повышать скорость исследования, а также высокой эко-номичности микрообъемные тест-системы имеют широкое применение в работе лабораторий.

Приготовление питательных сред

Компоненты питательных сред

Для натуральных питательных сред используют животные, растительные и микробные продукты: мясо, рыбную муку, молоко, яйца, кровь, картофель, дрожжи и др. Из них готовят полуфабрикаты: настои и экстракты (мясная вода, дрожжевой экстракт), ферментативные и кислотные гидролизаты (пептон, пере-вар Хоттингера, перевар казеина и др.). Настои и экстракты являются источни-ком факторов роста; гидролизаты − источником аминокислот и других органи-ческих питательных веществ. Минеральные соли вносят в следующих соотно-шениях: NaCl − 5,0 г/л; КН2РО4 − 0,2-0,5 г/л; MgSO4.7Н2О − 0,1-0,2 г/л; остальные соли − 0,001 г/л. Для специальных сред используют: многоатомные спирты (маннит, инозит и др.), аминокислоты, витамины , кровь , сыворотку крови, молоко и др. Из индикаторов рН чаще применяют индикатор Андреде (кислого фуксина − 0,5 г; раствора 1N NaOН − 17 мл; дистиллированной во-ды − 100 мл) или индикатор Кларка (1,5% спиртового раствора фенолового красного, метиленового красного, бромтимолового синего и др.). В качестве уплотнителя питательных сред используют агар-агар или желатин. Агар-агар − полисахарид, получаемый из морских водорослей − способен образовывать в воде гель, плавящийся при 80-86 оС и застудневающий при 40-45 оС, который не расщепляется большинством видов микроорганизмов. Желатин — белок, полу-чаемый из кожи и костей. Желатиновый гель плавится при 32-34 оС, образует студнеобразную массу при 26-28 оС (то есть при температуре инкубации 37 оС находится в жидком состоянии); расщепляется многими видами микроорганиз-мов. Желатин применяют редко.

Этапы приготовления питательных сред

Согласно прописи питательной среды в дистиллированную воду вносят необ-ходимые компоненты и растворяют при нагревании. При разведении белковых гидролизатов концентрация аминного азота должна оставлять 1,0-1,2 г/л, об-щего − 2,5-3,0 г/л; рН среды определяют с помощью индикаторных бумажек или электропотенциометров (с учетом того, что после стерилизации рН среды снизится на 0,2). Фильтруют жидкие и желатиновые среды через фильтроваль-ную бумагу; среды с агаром (в горячем состоянии) − через ватно-марлевый фильтр. При необходимости осветляют питательную среду посредством обра-ботки белком куриного яйца, сывороткой или осаждением. Разливают среду в колбы, флаконы, пробирки. Используют чистую нестерильную посуду, если среда подлежит стерилизации при 120 оС, или стерильную посуду, если среда требует стерилизации текучим паром (100 оС) или при 112 оС. Закрывают по-суду со средой ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками. В зави-симости от состава среды стерилизуют различными способами. Агаровые сре-ды, не содержащие углеводов и нативного белка, а также синтетические среды стерилизуют в автоклаве при 115-120 оС в течение 15-20 мин. Среды, содержа-щие углеводы, молоко, желатин, стерилизуют текучим паром при 100 оС дробно или в автоклаве при 112 оС в течение 15 мин. Среды, содержащие нативный бе-лок, мочевину, стерилизуют фильтрованием или добавляют стерильные компо-ненты (кровь, сыворотку и др.) в стерильную основу среды. Готовые стериль-ные питательные среды подвергают контролю на стерильность путем выдержи-вания в термостате при 37 оС в течение 1-3 суток.

В полевых условиях проще готовить питательные среды из сухих (консерви-рованных) питательных сред. Навеску сухой среды, указанную на этикетке, вно-сят в дистиллированную или водопроводную воду и кипятят до полного раство-рения порошка. Затем разливают среду в стерильные колбы, пробирки и стери-лизуют. Некоторые среды (например, Эндо, Плоскирева, Левина) можно ис-пользовать без стерилизации.

Техника приготовления некоторых полуфабрикатов и питательных сред общего назначения

Мясной настой (мясная вода)

Для приготовления настоя употребляют свежее говяжье мясо. Мышцы от-деляют от костей, освобождают от жира и соединительной ткани, измельчают в мясорубке, заливают водой из расчета 2 л воды на 1 кг мясного фарша и остав-ляют на 18-20 ч. при температуре 8-10 оС. Затем настой вместе с мясом нагре-вают до кипения и кипятят в течение 30 мин. Удаляют всплывающий на поверх-ность жир, доливают дистиллированной водой до первоначального объема, от-деляют настой от фарша через сито или марлю, фильтруют через ватный фильтр. Настой, не стерилизуя, употребляют для приготовления бульона или для хранения разливают в бутылки и стерилизуют при 120 оС в течение 30 мин. В мясном настое содержится азота общего − 2,00 г/л, азота аминного − 0,6 г/л.

Гидролизат (перевар) по Хоттингеру

Мясо (1 кг) нарезают кусочками примерно по 1-2 см3, опускают небольшими порциями в кастрюлю с двойным количеством (по отношению к мясу) кипящей воды, кипятят 15-20 мин., пока мясо не станет серым, затем извлекают из жид-кости шумовкой и пропускают через мясорубку. В оставшейся жидкости уста-навливают рН 8,0, опускают в нее фарш и охлаждают в кастрюле до 40 оС, после чего добавляют поджелудочную железу (очищенную от жира, соедини-тельной ткани и дважды пропущенную через мясорубку) в количестве 10 % от взятой жидкости (на 1 л жидкости 100 г железы) или сухой панкреатин в коли-честве 0,5 % и выше в зависимости от его активности. Хорошо размешивают, после чего снова подщелачивают через 30 мин. (отсутствие сдвига реакции в кислую сторону указывает на недоброкачественость фермента). После уста-новления рН смесь переливают в бутыль с плотной резиновой пробкой с таким расчетом, чтобы 1/3 бутылки оставалась свободной. Добавляют 1-3 % хлоро-форма (в холодное время года меньше, чем в теплое), закрывают бутыль проб-кой и несколько раз встряхивают, после чего на минуту вынимают пробку для освобождения от избытка паров хлороформа. Через 1-2 ч. после добавления фермента опять проверяют реакцию и устанавливают рН 7,4-7,6. Смесь остав-ляют на 10-16 дней при комнатной температуре или 7-10 дней при 37 оС. Первые 3-4 дня переваривания ежедневно проверяют и исправляют реакцию, а также встряхивают перевар не менее трех раз в сутки. В дальнейшем проверку проводить нецелесообразно, а встряхивать можно реже. За 1-2 дня до окончания переваривания прекращают встряхивание, чтобы перевар отстоялся. Окончание переваривания характеризуется следующими признаками: на дне бутылки соби-рается пылевидный осадок, жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет, реакция на триптофан с бромной водой положительная (максимальное содержание триптофана 2,00-3,00 г/л), в гидролизате содержится 11,00-12,00 г/л азота, 7,00-9,00 г/л аминного азота. По окончании гидролиза перевар фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, разливают в бутылки, колбы и стерилизуют при 120 оС в течение 30 мин. для хранения впрок.

Мясо-пептонный бульон

К мясному настою добавляют 1 % пептона, 0,5 % химически чистого натрия хлорида. Смесь кипятят при постоянном помешивании 15-20 мин., устанавли-вают рН 7,2-7,4, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и про-бирки, стерилизуют при 120 оС в течение 20 мин. Содержание аминного азота в готовой среде − 1,2 г/л.

Бульон Хоттингера

К 100-200 мл перевара Хоттингера добавляют 800-900 мл дистиллированной воды (в зависимости от концентрации аминного азота в переваре), затем добав-ляют 5 г хлорида натрия, 0,2 г дигидрофосфата натрия. Устанавливают рН 7,4-7,6, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при 120 оС в течение 20 мин. Содержание аминного азота в готовой среде − 1,00-1,20 г/л.

Мясо-пептонный агар

К 1 л мясо-пептонного бульона добавляют 15-25 г (1,5-2,5 %) мелко нарезанного агар-агара. Кипятят, перемешивая, до полного растворения агара. Устанавливают рН 7,4-7,6. Фильтруют, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при 120 оС в течение 20 мин.

Агар Хоттингера

К 1 л бульона Хоттингера добавляют 15-25 г (1,5-2,5 %) мелко нарезанного агар-агара. Кипятят, перемешивая, до полного растворения агара. Устанавливают рН 7,4-7,6. Фильтруют, разливают в колбы или пробирки, сте-рилизуют при 120 оС в течение 20 мин.

Желточно-солевой агар для выделения стафилококков

Готовят мясо-пептонный агар рН 7,2-7,4) с содержанием 10% хлорида натрия. После разлива во флаконы по 100-200 мл стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при температуре 1200 С. Перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до 45-500 С и добавляют 20% (по объёму) стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия). Среду быстро перемешивают и разливают в чашки.

Среда Эндо –дифференциально-диагностическая среда для бактерий кишечной группы (готовится непосредственно перед употреблением).

К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 700 С асептично добавляют 5 мл 20% раствора лактозы и смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина с 1,25 мл свежеприготовленного 10% раствора сульфита натрия.

Среды Гисса с углеводами для выделения сбраживания углеводов микроорганизмами.

Пептон-10 г, натрия хлорид-5 г, углевод-10 г, реактив Андреде-10 мл, дистилированная вода до 1000 мл. Разливают в пробирки с поплавками; рН после стерилизации 7,2-7,4.

Реактив Андреде 0,5 г кислого фуксина растворяют в 100 мл дистилированной воды, прибавляют 16,4 мл 1 н раствора гидроксида натрия, стерилизуют 5 мин при 1000 С и хранят в темном месте во флаконе с притертой пробкой. Приготовленный реактив должен иметь соломенно-жёлтый цвет.

Среда Сабуро -для культивирования грибов.

Пептон -10 г, глюкоза -10 г, агар-агар-20 г, дистилированная вода до 1000 мл.

Контроль питательных сред по биологическим и физико-химическим показателям

Бактериологическому контролю подлежат все серии питательных сред про-мышленного производства и все партии сред, приготовленных в лаборатории. В качестве тест-культур используют типовые или местные штаммы бактерий, ти-пичные по всем признакам, в гладкой форме. Тест-культуры хранят в лиофиль-но высушенном состоянии или в столбике полужидкого питательного агара. В дальнейшем перед использованием высевают на питательный агар и для полу-чения необходимых посевных доз разводят десятикратно стерильным 0,85% раствором натрия хлорида исходную взвесь культуры до концентрации 109 КОЕ в 1 мл. Определяют следующие биологические показатели питательной среды: чувствительность (ростовую), ингибирующие свойства, дифференцирующие свойства, скорость роста бактерий на среде, воспроизводимость.

Чувствительность питательной среды определяют по минимальному коли-честву колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий, обеспечивающих появ-ление роста колоний на среде, или другим способом − по максимальному де-сятикратному разведению культуры из исходной концентрации 10 ЕД мутности (по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича), обеспечива-ющему появление роста бактерий на всех засеянных чашках Петри. Ингибирующие свойства среды оценивают как степень подавления прочей микрофлоры по величине посевной дозы в КОЕ, полностью подавляемой на среде, или по отношению количества выросших колоний бактерий к расчетному количеству посеянных бактерий. Дифференцирующие свойства сред изучают путем посева испытуемых видов бактерий в смеси с ассоциантами с последую-щим определением четкости дифференциации колоний искомых бактерий от ассоциантов. Специфичность дифференцирующего свойства среды выявляют по отсутствию этого свойства у прочих видов бактерий, кроме искомых. Скорость роста бактерий на среде устанавливают по минимальному времени инкубации посевов (в часах), в течение которого обеспечивается четкий, видимый невоору-женным глазом, рост культуры (для селективных сред) или формирование ко-лоний с типичными дифференциальными признаками. Воспроизводимость био-логических показателей сред оценивают по частоте одинаковых результатов (в процентах) при повторных использованиях сред с теми же штаммами бактерий. Контроль различных питательных сред по биологическим показателям проводят по конкретным методикам и нормативам, руководствуясь официальными доку-ментами.

Физико-химический контроль питательных сред в практике лабораторий осу-ществляют по показателям рН, rH, содержанию аминного азота. Прочие по-казатели изучают обычно при промышленном производстве питательных сред. Для определения рН и rH сред используют рН-метры, индикаторные бумажки, а также различные химические индикаторы рН и rН, вносимые в питательные среды. Содержание аминного азота изучают методом рН-метрического формо-лового титрования питательных сред по ГОСТу.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

  1. Метаболизм как совокупность биохимических реакций, протекающих в бактериальной клетке, две стороны метаболизма.
  2. Питание бактерий.
  3. Классификация бактерий по типу питания, источникам энергии.
  4. Основные механизмы питания бактерий.
  5. Классификация бактерий по типу дыхания.
  6. Рост и размножение бактерий.
  7. Фазы размножения популяции бактерий в жидкой питательной среде.
  8. Основные группы ферментов бактерий и их классификация.
  9. Факторы роста.
  10. Этапы выделения чистой культуры бактерий.
  11. Определение микробиологических терминов: «вид», «штамм», «клон», «колония», «чистая культура».
  12. Классификация питательных сред.
  13. Требования к питательным средам.
  14. Методы стерилизации питательных сред.
  15. Способы культивирования бактерий.
  16. Методы выделения чистой культуры аэробных бактерий.
  17. Методы выделения чистой культуры анаэробных бактерий.
  18. Определение культуральных и биохимических свойств бактерий в целях идентификации и диагностики.

РАБОТА ПОД РУКОВОДСТВОМ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ

  1. Освоение техники посева бактериальной петлей, иглой, пипеткой, шпателем.
  2. Приготовление основных жидких и плотных питательных сред.
  3. Определение показателя рН мясо-пептонного бульона.
  4. Определение биохимических свойств микроорганизмов.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

  1. Из исследуемого материала приготовить мазок, окрасить по Граму или другим методом и микроскопировать.
  2. Произвести посев исследуемого материала на искусственные питательные среды.
  3. Нарисовать схему основных этапов выделения чистой культуры бактерий.
  4. Идентифицировать выделенные изолированные колонии по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам.
  5. Сделать посев изолированных колоний микроорганизмов на питательные среды с целью получения чистой культуры.

ТЕМА № 4. Асептика, антисептика, стерилизация

Различные методы микробной деконтаминации нашли широкое применение в пищевой промышленности. Знания этих разделов необходимы каждому техно-логу и товароведу.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Изучение основных методов дезинфекции и стерилизации, применяемых сегодня в пищевой промышленности.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Методы стерилизации и аппаратуру, используемую для этих целей.
  2. Методы определения эффективности дезинфекции и стерилизации.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Применять методы стерилизации и используемую аппаратуру.
  2. Контролировать эффективность действия антисептических и дезинфицирующих средств на микроорганизмы.
  3. Контролировать эффективность стерилизации.

Стерилизация

Стерилизация (от лат. sterilis – бесплодный) — освобождение от всего жи-вого, полное уничтожение в материалах всех микроорганизмов и их спор. При выборе метода и режима стерилизации в первую очередь оценивают устойчи-вость микроорганизмов к стерилизующему фактору.

Цели стерилизации

  1. Предупреждение заноса микробных клеток в организм человека.
  2. Исключение контаминации питательных сред и культур клеток.
  3. Предупреждение микробной биодеградации материалов.

В пищевой промышленности стерилизации подвергают посуду, упаковочный материал, а также продукты (молоко, соки, пиво и т.д.).

Методы стерилизации

  1. Прокаливание над пламенем, при котором происходит сгорание микроорганизмов и спор. Температура пламени горелки − 1560 0С.
  2. Стерилизация сухим жаром в сухожаровых стерилизаторах, используемая для стерилизации стеклянных, металлических, фарфоровых предметов, предварительно завернутых в бумагу или закрытых ватно-марлевыми пробками для сохранения стерильности.
  3. Паровая стерилизация, которой подвергаются изделия из текстиля, резины, стекла, питательные среды, баночные консервы:
    • 110 0С – в течение 180 мин;
    • 120 0С – в течение 45 мин;
    • 132 0С – в течение 20 мин.
  4. Воздушная стерилизация, которой подвергаются изделия из металла, стекла и др.:
    • 160 0С – в течение 150 мин;
    • 180 0С – в течение 60 мин.
  5. Дробная стерилизация текучим паром в автоклаве при 1000С или при нагревании на водяной бане при 60-800С. Этот метод применим к термолабильным предметам. В частности такой режим применяют при стерилизации продуктов, богатых витаминами, углеводовами, белками.
  6. Автоклавирование (самый надежный способ стерилизации).
  7. Кипячение.
  8. Газовая стерилизация.
  9. Химическая стерилизация.

Физические методы стерилизации

Прокаливанием на пламени горелки или спиртовки стерилизуют металли-ческие инструменты, бактериологические петли, иглы, пинцеты, предметные стекла.

Кипячение применяют для стерилизации посуды, мелкого инвентаря, на-конечников кондитерских мешков, резиновых трубок. Кипячением в дистиллированной воде стерилизуют мембранные фильтры. Режим стерилизации для мембранных фильтров – 30 – 60 мин с момента закипания воды. Металлические инструменты, мелкие стеклянные детати стерилизуют кипячение в течение 30 мин в специальных аппаратах-стерилизаторах. Следует помнить, что кипячение не обеспечивает стерильности объекта, если он заражен спорами некоторых бактерий.

Стерилизация сухим жаром применяется для обеспложивания стеклянной посуды, пробирок, колб, чашек Петри и пипеток, кондитерских мешков. Для этой цели используют сухожаровые шкафы (печи Пастера), в которых необхо-димый эффект достигается при температуре 160 0С в течение 2 часов, при тем-пературе выше 170 0С в течение 1 часа или 180 0С - 40 мин.

Принципиальные преимущества сухого жара заключаются в том, что при его применении не происходит коррозии металлов и инструментов, не поврежда-ются стеклянные поверхности; он пригоден для стерилизации порошков и не содержащих воды нелетучих вязких веществ. К недостаткам данного метода относятся медленная передача тепла и продолжительные периоды стерилиза-ции; при использовании сухого жара более высокие температуры (выше 170 0С) могут неблагоприятно действовать на некоторые металлы, а также вызывать обугливание и возгорание ватных пробок и бумаги. Кроме того, если нет цир-куляции воздуха, может происходить образование слоев воздуха с разными температурами.

При обработке сухим жаром микроорганизмы погибают в результате окис-ления внутриклеточных компонентов. Споры бактерий более устойчивы к су-хому жару, чем вегетативные клетки.

Стерилизация насыщенным паром под давлением — один из наиболее эффективных методов, так как стерилизуемый объект подвергается одновременному воздействию как высокой температуры, так и повышенному давлению пара. Погибают как вегетативные клетки, так и споры микроорганизмов. Паром под давлением стерилизуют различные питательные среды (кроме содержащих нативные белки), жидкости, приборы, резиновые предметы, стеклянную посуду с резиновыми пробками. Для этой цели применяют паровые стерилизаторы (автоклавы).

Автоклав поредставляет собой двухстенный металлический котел с игерметически закрывающейся крышкой (рис.13). В пространство между стенками автоклава наливают воду. Внутри котла имеются отверстия для выхода пара, образующегося при нагревании воды. Снаружи котел одет в металлическую «рубашку», в которую встроены два манометра, показывающие давление пара внутри котла и между стенками.

Автоклав

Рисунок 13. Автоклав

Большинство паровых стерилизаторов относится к гравитационным: пар дви-жется в них сверху вниз под действием разности плотностей пара и воздуха. В таких стерилизаторах существенны проблемы проникновения влаги, перегрева, удаления воздуха, а также отрицательные последствия, вызываемые воздейст-вием тепла и (или) влаги. Весьма важны правильное приготовление стерили-зуемых образцов и надлежащая загрузка.

Правила работы с паровыми стерилизаторами следующие.

  1. Перед началом стерилизации проверить исправность манометров, упру-гость резиновой прокладки, герметичность крепления крышки стерилизацион-ной камеры.
  2. Наполнить котелок водой через воронку до уровня отметки на кожухе водомерной трубки и закрыть верхний кран водоуказательной колонки.
  3. Загрузить материалы в стерилизационную камеру и плотно закрыть крыш-ку стерилизатора.
  4. Закрыть спускной кран и выключить нагревательную систему.
  5. После достижения давления пара в котле 2,0±0,2 кгс/см открыть спускной кран, а затем вентиль патрубка, соединяющего котелок со стерилизационной камерой. Появление из крана непрерывной струи пара следует считать началом продувки (вытеснение воздуха из стерилизационной камеры), которая должна продолжаться не менее 30 мин.
  6. Закрыть спускной кран и довести давление в стерилизационной камере до нужного уровня, учитывая соотношение показания манометра и температуры кипения воды (табл. 1).
  7. Окончив стерилизацию, выключить электрический подогрев и закрыть кран на патрубке.
  8. Открыть спускной кран и постепенно выпустить пар из стерилизационной камеры в сосуд с водой.
  9. После снижения давления в стерилизационной камере до 0 0С открыть крышку стерилизатора и приступить к его разгрузке; при открытии крышки ранее указанного срока стерилизуемая жидкость вскипает и может вытолкнуть пробки из сосудов вследствие быстрого падения давления. Режимы стерилизации представлены в таблице 1.

Таблица 1. Соотношение показаний манометра и температуры кипения воды

Показания манометра, атм

Температура кипения воды оС

Показания манометра, атм

Температура кипения воды оС

0

100

0,7

116

0,2

105

0,8

117

0,4

110

1,0

121

0,5

112

1,5

127

0,6

114

2,0

134

Основные используемые режимы стерилизации следующие: 15 – 30 мин. при избыточном давлении 0,5 атм (стерилизуют питательные среды с углеводами); 15-45 мин при избыточном давлении 1,0 атм (стерилизуют питательные среды без углеводов, воду, растворы, фильтры, посуду); 10 – 30 мин при избыточном давлении 1,5 атм (обеззараживают условно-патогенный материал).

Контроль режима стерилизации осуществляется с помощью химических термотестов и искусственных биотестов.

Химические термотесты представляют собой вещества, изменяющие свой цвет или физическое состояние при стерилизации, в частности вещества, имеющие различную температуру плавления (табл. 2).

Таблица 2. Показатели температуры плавления порошков-индикаторов

Название химического вещества-индикатора

Температура плавления, оС

Название химического вещества-индикатора

Температура плавления, оС

Бензонафтол

110

Резорцин чистый

118

Антипирин

115

Бензойная кислота

121

На 100 г порошка индикатора прибавляют 0,01г сафранина, 0,005 г фуксина или метиленового синего.

Запаянные ампулы с порошком, смешанным с краской, помещают в стери-лизационную камеру. При достижении в камере определенной температуры порошок плавится, образуя сплав, окрашенный в цвет добавленной краски.

Бактериологический контроль режима стерилизации заключается в том, что в стерилизационную камеру помещают искусственные биотесты – пробирки с полосками марли, фильтрованной бумаги или шелковинками, зараженными микроорганизмами с известной устойчивостью к температурным воздействиям. На чашки с питательным агаром засевают 3-4 различных штамма споровых па-лочек из группы Bacillus mesentericus, выдерживающих кипячение в течение 2 ч. Посевы ставят в термостат на 48 ч., после чего их выдерживают при комнатной температуре в течение 5 суток. Затем культуры смывают с поверхности агара водой с помощью шпателя, сливают в колбочку со стерильными бусами и энер-гично встряхивают в течение 2-3 мин. Полученную взвесь микробов фильтруют через рыхлый ватный фильтр для удаления крупных частиц и разводят по стан-дарту до концентрации 2 млрд микробных клеток в 1 мл.

Кусочки марли или бельевой ветоши площадью около 1 см2 пропитывают микробной взвесью и раскладывают на дно пробирок, закрытых ватно-марле-выми пробками. Пробирки необходимо на несколько часов поставить в умерен-но теплое место (термостат, батарея центрального отопления) для того, чтобы биотесты проросли. После этого их можно хранить в лаборатории в течение года.

Зарубежные фирмы поставляют биотесты, представляющие собой полоски с нанесенными на них спорами одного или двух видов бактерий, со спорами из-вестной численности, со спорами и определенным количеством культуральной среды, суспензиями спор и т. д.

Биотесты закладывают в центральную часть каждого бикса или мешка, содер-жащих бельё, перевязочный и другой материал, подлежащий стерилизации. После вскрытия бикса или мешка (во время работы) биотесты направляют в лабораторию.

В лаборатории в пробирку с биотестом заливают 5-10 мл сахарного бульона и посевы инкубируют в течение 48 ч. при 37 0С.

При наличии визуального роста готовят мазки или высевы на мясо-пептонный агар для идентификации культуры.

Стерилизация текучим паром (дробная стерилизация) — это обеспложива-ние объектов, разрушающихся при температуре выше 100 0С (питательные среды с аммиачными солями, молоко, желатин, крахмал, некоторые углеводы). Обеспложивание проводят в паровом стерилизаторе при открытом спускном кране и незавинченной крышке или в аппарате Коха по 15-30 мин. в течение 3 дней подряд. При первой стерилизации погибают вегетативные формы микро-бов, некоторые споры при этом сохраняются и прорастают в вегетативные осо-би в процессе хранения питательных сред при комнатной температуре. После-дующая стерилизация обеспечивает достаточно надежное обеспложивание объекта.

Тиндализация — это стерилизация вещест, легко разрушающихся при вы-сокой температуре (витамины, аминокислоты); стерильность достигается пов-торным прогреванием объекта при температуре 60 0С по 1 часу ежедневно в течение 5-6 дней подряд.

Пастеризация — это обеспложивание многих пищевых продуктов (вино, пиво, соки), при этом достигается только частичная стерильность; споры микро-организмов не уничтожаются. Обеспложивание проводят при 65-80 0С в течение 10-60 мин., затем резко охлаждают. Последующее хранение при низкой температуре (4-50С) препятствует прорастанию спор и размножению оставшихся в продукте микроорганизмов.

Стерилизация ультрафиолетовыми лучами применяется для обеспложи-вания воздуха в микробиологических лабораториях, кондитерских цехах.

Ультрафиолетовые лучи (250 – 270 нм) используются для стерилизации центрифужных пробирок, наконечников для пипеток, материалов из термолабильной пластмассы. Время облучения определяется мощностью лампы, временем воздействия, степенью и видовым составом микроорганизмов загрязненного материала. Вегетативные формы более чувствительны к облучению, чем споры, которые в 3 – 10 раз более устойчивы. Ограничением при использовании данного метода стерилизации является низкая проникающая способность УФ-лучей и высокая поглощающая способность воды и стекла.

Рентгеновское и g-облучение также эффективно для стерилизации пластмасс, пищевых продуктов, но требует строгого соблюдения правил безопасности. Наиболее чувствительны к g-облучению вегетативные клетки бактерий, затем идут плесневые грибы, дрожжи, бактериальные споры и вирусы. В большинстве случаев для надежного уничтожения микроорганизмов достаточно дозы облучения 2,5 Мрад. g-Облучение используется для стерилизации антибиотиков, витаминов, гормонов, стероидов.

Радиационный метод применяют обычно на специальных установках при промышленной стерилизации изделий однократного применения.

Механические методы стерилизации

Фильтрование применяют в тех случаях, когда повышенная температура мо-жет резко повлиять на качество стерилизуемых материалов (питательные среды, сыворотки, антибиотики), а также для очистки бактериальных токсинов, фагов и различных продуктов жизнедеятельности бактерий. Как окончательный про-цесс он менее надежен, чем стерилизация паром, из-за большой вероятности прохождения микроорганизмов через фильтры.

Фильтры задерживают микроорганизмы благодаря поровой структуре их материала. Существуют два основных типа фильтров – глубинные и мембран-ные.

Глубинные фильтры состоят из волокнистых или гранулированных матери-алов, которые спрессованы, свиты или связаны в лабиринт проточных каналов. Частицы задерживаются в них в результате адсорбции и механического захвата в материале фильтра. Фильтры Шамберлана изготовляют из каолина с при-месью песка и кварца. Они имеют вид свечей с различными размерами пор и обозначаются L1, L2, L3 и т.д. Следует запомнить, что фильтры L5-L13 бактерий не пропускают. Для фильтра Беркефельда используют инфузорную землю. Размеры пор в порядке увеличения обозначаются буквами W, N, V.

Мембранные фильтры имеют непрерывную структуру; их получают из нитро-клетчатки, и захват ими частиц определяется, в основном, размером пор. В за-висимости от размера пор мембранные фильтры обозначают номерами 1-5 (диа-метры пор 350-1200 нм).

Фильтрацию материалов производят под вакуумом, который создают ваку-умным или водоструйным насосами. Фильтры Шамберлана и Беркефельда сое-диняют с вакуумной колбой Бунзена резиновыми трубками и перед фильтраци-ей стерилизуют в паровом стерилизаторе при 120 0С. Мембранные фильтры пос-ле предварительной стерилизации кипячением вставляют в аппарат Зейтца, состоящий из асбестовой пластинки, вмонтированной в металлическую ворон-ку, которую через резиновую пробку присоединяют к колбе Бунзена.

Контроль режима стерилизации

Для контроля режима стерилизации используют тест-культуру Bacillus stearothermophilus (споры погибают при 121 °С за 15 мин.).

Для контроля действия автоклава пользуются также физическим методом плавления: например, в автоклав помещают бензонафтол (температура плавления – 110 °С), антипирин (температура плавления – 113 °С), бензойную кислоту (температура плавления – 120 °С). Если температура в автоклаве доста-точна, вещества расплавляются и окрашиваются в цвет, соответствующий взятому красителю.

Дезинфекция

Дезинфекция — это мероприятия, направленные на уничтожение или резкое подавление численности патогенных и условно-патогенных микроорганизмов во внешней среде, в том числе на объектах и изделиях. Целью дезинфекции является предупреждение или прерывание передачи возбудителей от инфицированного индивидуума к интактному через объекты внешней среды.

Методы дезинфекции

Дезинфекция (от лат. Infectia – инфекция и франц. отрицательной приставки des), в отличие от стерилизации, означает уничтожение во внешней среде толь-ко возбудителей инфекционных заболеваний. В зависимости от характера дей-ствующего агента различают физический и химический методы дезинфекции.

Физический метод сводится к механической очистке объектов (орошение, мытье, чистка, вытряхивание и выколачивание, влажная уборка, вентиляция помещений). Он не позволяет достигнуть полного обеззараживания обрабаты-ваемых объектов. Однако физические способы дезинфекции приводят к значи-тельному уменьшению числа патогенных микроорганизмов во внешней среде.

В микробиологической практике широкое применение нашли способы хими-ческой дезинфекции (рук, рабочего места, посуды, градуированных и пастеров-ских пипеток, стеклянных шпателей, стекол). Вещества, предназначенные для дезинфекции, должны обладать рядом свойств:

  1. хорошо растворяться в воде;
  2. в короткие сроки проявлять бактерицидное действие;
  3. не утрачивать обеззараживающих свойств при наличии органических примесей в среде, подлежащей обработке;
  4. не оказывать токсического действия на людей и животных;
  5. не портить обеззараживаемые объекты;
  6. достаточно долго сохранять бактерицидные свойства при хранении в сухом виде или растворе, а также при контакте с обеззараживаемыми объектами;
  7. быть дешевыми и удобными при транспортировке.

Дезинфицирующее вещество, его концентрация, а также продолжительность срока дезинфекции определяют в зависимости от конкретных условий. В основ-ном учитывают устойчивость обеззараживаемых микробов, степень предпола-гаемого загрязнения, состав и консистенцию материала, в котором они нахо-дятся. В процессе обеззараживания необходимо обеспечить возможность наи-лучшего перемешивания, чтобы создать наиболее тесный контакт дезинфици-рующего вещества с обеззараживаемым материалом.

Асептика

Асептика — комплекс мероприятий, направленных на предупреждение попа-дания микробов в рану. Асептическая практика в биотехнологии и производстве многих лекарственных препаратов. Таким образом, предупреждают или сни-жают риск попадания микроорганизмов в «рабочую зону», которой может быть питательная среда, пищевой продукт.

Антисептика

Антисептика — это комплекс мероприятий направленных на подавление па-тогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Главным методом антисеп-тики является обработка химическими веществами с преимущественно бак-терио-статическим действием с учетом спектра их антимикробной активности и чувствительности конкретных возбудителей. Деконтаминация с помощью анти-септиков предполагает подавление патогенных и условно-патогенных микро-организмов при условии сохранения непатогенных видов. Классификация дезинфицирующих и антисептических средств представлена в Табл. 3.

Таблица 3. Классификация дезинфицирующих и антисептических средств

Основные группы дезинфицирующих и антисептических средств

Препараты

  1. Галогенсодержащие соединения
  • Хлорсодержащие вещества: хлорная известь, хлорамин Б.
  • Йодсодержащие вещества: спиртовой раствор йода, раствор Люголя.
  • Метилбромид.
  1. Кислородсодержащие вещества (окислители)
Перекись водорода, перманганат калия, озон, оксид этилена.
  1. Поверхностно-активные вещества
Четвертично-аммониевые соединения (ЧАС): катамин Б; хлоргексидина биглюконат.
  1. Спирты
Этиловый спирт в виде 76% -го раствора, амиловый спирт, 1-пропанол, 2-пропанол
  1. Альдегиды
Глутаровый альдегид, формальдегид.
  1. Фенолы
Гексахлорофен, 3-5% растворы лизола.
  1. Кислоты и щелочи
Уксусная кислота, бензойная, надуксусная, салици-ловая, молочная, пропионовая, 2-10% растворы гидроксида калия или натрия.
  1. Красители
Бриллиантовый зелёный.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

  1. Действие температурных параметров на микробную клетку.
  2. Влияние физических факторов и химических веществ на микроорганизмы.
  3. Стерилизация, цели и методы стерилизации.
  4. Основные методы дезинфекции.
  5. Основные понятия об асептике и антисептике.
  6. Методы контроля эффективности стерилизации.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

  1. Осуществить учет результатов опытов, поставленных с тестами для контроля эффективности стерилизации.
  2. Определить по готовым посевам антибактериальное действие УФ-лучей на стафилококк.
  3. Учесть результаты опытов, поставленных для определения анти-микробного действия антисептических и дезинфицирующих веществ.

ТЕМА № 5. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Ознакомление с методами определения чувствительности микроорганизмов к факторам внешней среды: физическим, химическим и биологическим.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Характиристика физических факторов, оказывающих воздействие на микроорганизмы.
  2. Основные группы антибиотиков.
  3. Механизмы антибактериального действия антибиотиков.
  4. Качественные и количественные методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

Правильно применять методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

Факторы внешней среды, действующие на микроорганизмы, подразделяют на физические и химические. Их эффект может быть как стимулирующим рост, так и угнетающим его. Например, химические вещества, используемые клеткой для поддержания жизнедеятельности; определенная обеспечивающая рост температура и т. д. Химические вещества или факторы физической природы, полностью или частично угнетающие рост и задерживающие развитие микроорганизмов, относят к бактериостатическим. Бактерицидные факторы вызывают гибель микроорганизмов. Характер действия (бактерицидный или бактериостатический) зависит от концентрации или дозы действующего агента, продолжительности контакта и вида микроорганизма.

Химические соединения по характеру действия на клетку могут быть разделены на:

  1. повреждающие поверхностные структуры клетки и нарушающие проницаемость цитоплазматической мембраны (различные эфиры, спирты, нейтральные мыла, поверхностно-активные вещества, некоторые антибиотики);
  2. повреждающие ферменты и вызывающие нарушения обмена веществ (катионы тяжелых металлов, спирты, фенолы, хлор, фтор, озон);
  3. нарушающие синтез клеточных структур (антибиотики).

К физическим факторам, оказывающим выраженное действие на микроорганизмы, принадлежат: температура, осмотическое и гидростатическое давление, окислительно-восстановительные условия среды, влажность, ионизирующее излучение, лучистая энергия, электромагнитные колебания и ультразвук, радиоактивное излучение, механические воздействия и т. д.

Действие физических и химических факторов на микроорганизмы определяют по изменению характера роста в сравнении с культурой, не подвергшейся воздействию.

Изучение действия УФ-света на микроорганизмы

Среди разнообразных видов излучения, применяемых в качестве инактивирующих и мутагенных агентов, наиболее часто используются ультрафиолетовые и ионизирующие лучи, различающиеся между собой длиной волны (частотой излучения). В диапазоне от 4000 до 10 Å говорят об ультрафиолетовых лучах, а в диапазоне от 10 до 0,1 Å – об ионизирующем излучении. УФ-свет и ионизирующее излучение поглощаются ДНК клетки, в которой они вызывают различные нарушения. Ионизирующие излучения индуцируют в молекулах ДНК одно- и двунитевые разрывы углеводно-фосфатных цепей и изменения азотистых оснований. Основными фотопродуктами в ДНК после действия УФ-лучей являются циклобутановые димеры тиминовых оснований, располагающиеся в одной нити. Наибольший летальный эффект УФ-лучей наблюдается при длине волны 260 нм, при которой отмечается максимум поглощения УФ-лучей молекулами ДНК.

При определении чувствительности бактерий к УФ-облучению 0,1 мл 18-часовой бактериальной культуры, выращенной в жидкой питательной среде, засевают с помощью шпателя на поверхность полноценной агаризованной среды в чашке Петри. После этого на поверхность среды помещают диск плотной бумаги в качестве экрана, защищающего клетки бактерий от воздействия УФ-лучей. Облучение проводят в открытых чашках Петри с помощью бактерицидной лампы ДБ-15 в течение 3 мин на расстоянии 40 см. По окончании облучения стерильным пинцетом снимают диск бумаги, чашки Петри закрывают и помещают в термостат для инкубирования при оптимальной температуре. При учете результатов отмечают, что культура чувствительна к УФ-свету, если сплошной рост наблюдается только в зоне помещенного диска, на остальной поверхности среды в чашке – единичные колонии или полное отсутствие роста.

Образование антибиотических веществ

В процессе жизнедеятельности многие микроорганизмы образуют специ-фические продукты, которые обладают высокой физиологической активностью по отношению к другим микрорганизмам и вирусам, задерживая их рост или убивая их. Они называются антибиотиками. В промышленных масштабах антибиотики получают путём биосинтеза микроорганизмами-продуцентами и полусинтетически, трансформируя химическим путем молекулы природных антибиотиков. Знание химического строения природных антибиотиков позволяет получать некоторые из них, например, левомицетин, путем химического синтеза. Антибиотики обладают способностью убивать или тормозить рост и развитие микроорганизмов. В связи с этим различают бактериостатическое и бактерицидное действие антибиотиков. В отношении противогрибковых антибиотиков говорят о их фунгистатической и фунгицидной активности.

Многими исследователями показана эффективность применения антибиотиков для задержки микробной порчи скоропортящихся пищевых продуктов, особенно в сочетании с холодом.

Разрешается использование лишь некоторых антибиотиков (нистатина и биомицина) и только в ограниченных случаях (например, при транспортировании на дальние расстояния) для сырых продуктов (мясо, рыба), которые в последующем сохраняются на холоде. Допустимое содержание антибиотиков в продукте строго регламентируется, и требуется полное разрушение его в процессе обычной тепловой кулинарной обработки.

Для количественного выражения биологической активности вещества введено понятие единицы действия (ЕD). За единицу действия антибиотика принимают минимальное количество вещества, которое задерживает рост и стандартного штамма микроорганизма в строго определенных условиях. Для большинства антибиотиков 1 ЕD соответствует 1 мкг химически чистого препарата.

Современные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам делят на методы серийных разведений и диффузионные методы.

Методы серийных разведений основаны на определении основного коли-чественного показателя, характеризующего микробиологическую активность антибиотика − величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК), то есть минимальной концентрации, подавляющей рост исследуемого микро-организма. Для этого заданные концентрации антибиотика вносят в питатель-ную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма, и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро- и микроразведений.

Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диф-фузии антибиотика в плотной питательной среде и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация антибиотика превосходит МПК.

В диско-диффузионном методе в качестве носителя антибиотика используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии антибиотика из носителя в питательную среду. Величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК.

Для оценки чувствительности необходимо использовать только специально предназначенные для этой цели среды (Мюллера − Хинтона, АГВ и др.).

Вид питательной среды для оценки чувствительности определяется выбран-ным методом проведения исследования (агар или бульон), а также видом тес-тируемого микроорганизма. Выбранная питательная среда для определения чув-ствительности готовится из сухой среды промышленного производства в со-ответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду сразу же разливают в стерильные пробирки или в чашки Петри, или (если необходимо) колбы со средой помещают на водяную баню при 48–500С, где вы-держивают до достижения указанной температуры, после чего в них асепти-чески вносят термолабильные питательные добавки и/или рабочие растворы антибиотиков, а затем разливают в пробирки или в чашки Петри.

Агар разливается по чашкам слоем 4 мм (на чашку диаметром 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм − 20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным обра-зом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хра-нение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при 4-8 0С в течение недели.

Приготовление суспензии (инокулюма) исследуемой культуры

Концентрация бактерий должна составлять 1,5´108 КОЕ/мл. Оптическая плотность бактериальной суспензии с данной концентрацией соответствует стандарту мутности 0,5 по Мак-Фарланду. Существуют коммерчески доступные стандарты мутности и спектрофотометры.

Приготовление суспензии из агаровой культуры

Отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносят незначи-тельное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором или питательным бульоном, доводя плотность до 0,5 по стандарту Мак-Фарланда. Приготовленную суспензию следует исполь-зовать в течение 15 мин. после приготовления.

Приготовление суспензии из бульонной культуры

Можно использовать 5-6-часовую бульонную культуру микроорганизма. Для этого отбирают несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносят незначительное количество материала в пробирку с 5,0 мл жидкой неселективной питательной среды. Инкубируют при 35 0С. Примерно через 5-6 ч. инкубации плотность микробной суспензии приблизительно соответствует необходимой, и ее точно доводят до 0,5 по Мак-Фарланду путем добавления стерильного бульона или физиологического раствора.

Диско-диффузионный метод

Метод основан на способности антибиотика диффундировать из пропитан-ных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганиз-мов, посеянных на поверхности агара.

Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изго-товителя. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанав-ливают на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Соблюдение указанных предосторожностей необхо-димо в связи с тем, что размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глу-бины и равномерности агарового слоя.

При использовании свежеприготовленных чашек или чашек после хранения в холодильнике их необходимо подсушить перед инокуляцией, что достигается инкубацией при 35 0С с приоткрытой крышкой в течение 10-20 мин. Перед инокуляцией необходимо проконтролировать отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек.

Для определения чувствительности следует использовать только стандарти-зированные качественные диски. При определении чувствительности диско-диффузионным методом используют стандартный инокулюм, соответствующий по плотности 0,5 по стандарту Мак-Фарланда и содержащий примерно 1,5х108 КОЕ/мл. Инокулюм следует использовать в течение 15 мин. после приготовления. Стандартный инокулюм наносят пипеткой на поверхность чашки Петри с питательной средой в объеме 1-2 мл, равномерно распределяют по поверхности покачиванием, после чего удаляют избыток инокулюма пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин.

Не позднее, чем через 15 мин. после инокуляции на поверхность питательной среды наносят диски с антибиотиками. Аппликацию дисков проводят с помощью стерильного пинцета или автоматического диспенсера. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с антиби-отиком. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.

Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещают в термостат кверху дном и инкубируют при температуре 35оС в течение 18-24 ч. (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма).

После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную ма-товую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 450 (учет в отра-женном свете). Диаметр зон задержки роста измеряют с точностью до 1 мм (рис.14).

Диско-диффузионный метод

Рисунок 14. Диско-диффузионный метод

При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на зону полного подавления видимого роста. Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны подавления роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры.

Фитонциды

Антибиотические вещества вырабатываются не только микроорганизма-ми, но также растениями и животными. Фитонциды – это вещества, выделяемые растениями и обладающие антимикробным действием. Химическая природа фитонцидов разнообразна. Антимикробным действием обладают многие вещества, находящиеся в растениях: эфирные масла, гликозиды, антоцианы, дубильные вещества и многие другие, химическая природа которых еще не раскрыта.

Антимикробными свойствами обладают многие употребляемые в пищу овощи, пряности. Из чеснока и некоторых сортов репчатого лука выделен аллицин, из репы и редьки — рапин, из томатов — томатин. Эти вещества активны в отношении различных бактерий.

Для изучения действия фитонцидов на бактерии можно воспоьзоватося диско-диффузионным методом, помещая на поверхность питательной среды вместо дисков небольшое количество измельчён-ного растительного материала (натёртый на тёрке чеснок).

После термостатирования при температуре 37 0 С выявляют действие фитон-цидов чеснока на исследуемые бактерии. Устанавливают вокруг кашицы чес-нока наличие «серильной зоны» - зоны отсутствия роста бактерий и зоны угне-тения (несплошной, рассеянный рост колоний).

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

  1. Антибиотики. Классификация антибиотиков по химическому составу, по источнику получения, по механизму действия, по спектру действия.
  2. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

  1. Поставить опыт по определению чувствительности кишечной палочки и культуры пекарских дрожжей к УФ-излучению.
  2. Поставить опыт по определению чувствительности кишечной палочки к различным антибиотикам методом дисков.

ТЕМА № 6. Количественное определение микроорганизмов

Различные методы количественного определения микроорганизмов нашли широкое применение в пищевой промышленности. Знания этих разделов необходимы каждому технологу и товароведу.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Изучение основных методов количественного определения микроорганизмов

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Методы количественного определения микроорганизмов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Применять методы количественного определения микроорганизмов на практике.
  2. Заполнять счётную камеру Горяева и определять количество дрожжевых клеток в 1 г прессованных дрожжей.
  3. Определять коли-титр воды.

Количественное определение микроорганизмов методом непосредственного (прямого) подсчёта

Сущность метода состоит в том, что количество микроорганизмов опре-деляют путём прямого счёта их под микроскопом. Положительной стороной этого метода является простота и быстрота получения результата.

Метод широко применяется в практике микробиологических исследований. Например, свежесть мяса и рыбы определяется прямым микроскопированием мазков-отпечатков, взятых с продукта (бактериоскопия); аналогично устанав-ливается присутствие посторонней микрофлоры в кисломолочных продуктах; метод широко используется при оценке качества пива, прессованных хлебо-пекарных дрожжей.

Этот метод рекомендуется использовать для подсчёта крупных объектов-дрожжей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий. Опре-деление количества микроорганизмов методом прямого подсчёта производят в специальных счетных камерах Горяева-Тома (Рис. 15).

Счётная камера Горяева-Тома

Рисунок 15. Счётная камера Горяева-Тома: а-вид сверху; б-вид сбоку; в-при малом увеличении микроскопа

Камера Горяева представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками. На центральную часть стекла нанесена сетка. Площадь квадрата сетки указана на одной из сторон предметного стекла и соответствует 1/25 мм2 (большой квадрат) или 1/400 мм2 (малый квадрат). Часть предметного стекла, на которой нанесена сетка, на 0,1 мм ниже двух других сторон. Это глубина камеры; она всегда указывается на предметном стекле.

При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее за-полнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противо-положные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что пок-ровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящийся в камере, соответствует расчетному. После этого камеру заполняют исследуемой суспензией микроорганизмов. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой. Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3—5 мин после заполнения камеры, что-бы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости. Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или сус-пендированием в 0,5%-ном водном растворе формалина.

Число клеток подсчитывают с объективом 8 X или 40 X. С иммерсионным объективом работать нельзя, так как его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верх-нюю и правую стороны квадрата. При подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом—10, в противном случае исходную суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600.

Точность определения зависит от того, насколько плотно пришлифовано покровное стекло к поверхности камеры, поэтому подсчет клеток повторяют 3—4 раза, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее исследуемой взвесью микроорганизмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количество клеток в 1мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле:

M=\frac{a\cdot 10^3\cdot n}{h\cdot S} [6.1]

где

  • М—число клеток в 1 мл суспензии;
  • а — среднее число клеток в квадрате сетки;
  • h — глубина камеры в мм;
  • S—площадь квадрата сетки в мм2;
  • 103 — коэффициент перевода см3 в мм3;
  • n — разведение исследуемой суспензии.

Определение количества дрожжевых клеток в 1 г прессованных хлебопекарных дрожжей с помощью камеры Горяева

Для работы используют 0,1%-ную взвесь прессованных дрожжей (0,1 г/100 мл), которой заполняют камеру с помощью пипетки Пастера, и через несколько минут, когда дрожжи осядут на дно камеры,начинают подсчёт при объективе 8 X или 40 X. Для получения достоверных результатов подсчёт следует вести в трех препаратах в 5 больших (площадь 1/25 мм2) или в 20 малых (площадь 1/400 мм2) квадратах. Затем находят среднее количество дрожжевых клеток в одном квадрате, т.е. фактически в объёме 1/250 мм2 (1/25 мм2X1/10 мм) или 1/4000 мм2 (1/400 мм2 X 1/10 мм ). При умножении найденного среднего числа на знаменатель дроби (250 и 4000) находят количество дрожжевых клеток в 1 мм3, умножая на 1000, - в 1 см3 (мл) взвеси. Далее количество дрожжевых клеток в

1 г прессованных дрожжей можно определить по формуле:

X=\frac{a\cdot b}{c} [6.2]

где

  • a – количество дрожжевых клеток в 1 мл взвеси;
  • b – объём приготовленной взвеси, мл;
  • c – навеска прессованных дрожжей, г.

Установлено, что в I г доброкачественных прессованных дрожжей содержится от 8 до 12 млрд. жизнеспособных клеток. Так как прямой подсчет не дает возможность отличить живые клетки от мертвых, то количество последних устанавливается дополнительным исследованием.

Для этого каплю взвеси дрожжей помещают на предметное стекло, добав-ляют к ней на кончике спички метиленовой синьки (окраска капли должна быть голубая, а не синяя), накрывают покровный стеклом и через 1-2 минуты микроскопируют при объективе 40х. Подсчитывают количество окрашенных и неокрашенных клеток в 10 полях зрения, находят среднеарифметический процент мертвых клеток и уменьшают на это количество сумму дрожжевых клеток в I г.

Определение количества микробных клеток фотометрическим методом

Этот метод широко применяется в микробиологических исследованиях, так как позволяет достаточно точно и сравнительно быстро определить количество клеток в культуральной среде. В основе метода лежит измерение количества света, рассеянного взвесью клеток. Микроорганизмы в большинстве случаев не окрашены и почти прозрачны, поэтому суспензии клеток в видимой области спектра поглощают свет незначительно. Уменьшение интенсивности света после его прохождения через взвесь клеток связано, главным образом, с его рассеиванием. В определенных пределах рассеивание света клетками пропорционально их численности. Следует помнить, что количество рассеянного света пропорционально отношению размера частицы к длине волны падающего света. При постоянной длине волны падающего света, светорассеяние зависит от размеров клетки и будет тем большим, чем крупнее клетки и измерение светорассеяния целесообразно для тех культур микроорганизмов, развитие которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клетки, образованием мицелия, пленок и других скоплений.

Величину светорассеяния измеряют с помощью спектрофотометров или фотоэлектроколориметров. В этих приборах измеряется первичный пучок света, который проходит через пробу и, не отклоняясь, падает на фотоэлемент. Обычно при этом сравнивается интенсивность света, проходящего через суспензию клеток и через среду без клеток. Для измерения светорассеяния выбирают светофильтр, обеспечивающий максимум пропускания света данной взвесью. Питательная среда для культивирования микроорганизмов, в которой предполагается определять количество клеток по рассеиванию, должна быть оптически прозрачной.

Количество клеток определяют по калибровочной кривой, отображающей зависимость между величиной светорассеяния и числом клеток в единице объема исследуемой взвеси. Для построения калибровочной кривой поступают следующим образом. Измеряют величину светорассеяния взвеси с различным содержанием клеток и в каждой из них одним из доступных способов подсчитывают количество клеток в единице объема. Полученную зависимость выражают графически, откладывая на осях: абсцисс – показания спектрофотометра, ординат – количество клеток, содержащихся в 1 мл. Калибровочные кривые индивидуальны для каждой культуры; для определенных условий выращивания культуры (состав среды, температура, аэрация и т. д.).

Определение числа клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха).

В отличие от подсчета клеток под микроскопом, этот метод дает возможность определить только число жизнеспособных клеток в популяции. Поскольку сред, одинаково пригодных для роста различных микроорганизмов, не существует, метод высева дает возможность определить число клеток микроорганизмов, способных расти на среде данного состава, но не позволяет учесть те микроорганизмы, которые не растутут или растут крайне медленно.

Метод широко применяется для опредления численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных питательных средах. Сущность его заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на плотную среду в чашки Петри и подсчете выросших после инкубации колоний. Принято считать, что каждая колония - потомство одной клетки.

Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.

Приготовление разведений

Численность популяции микроорганизмов обычно достаточно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в водопроводной воде или 0,85%-ном растворе NaCl, используя постоянный коэффициент разведения, чаще всего равный 10. В ходе опыта целесообразно использовать один и тот жеикоэффициент разведения, так как это уменьшает вероятность ошибки. Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл иссле-дуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды — это 1-е разведение,10-1. Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3—5 раз, затем этой же пипеткой отбирают 1 мл полученной суспензии и переносят во 2-ю пробирку — получают 2-е разведение, 10-2. Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.

Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата.

Проведение посева

Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом.

Перед посевом поверхностным способом (рис. 16) разливают расплавлен-ную, чаще всего агаризованную, питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15—20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверх-ности, пока среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушивать для удаления конденсационной воды. С этой целью чашки Петри открывают и застывшей средой вниз помещают на 20-30 мин в сушильный шкаф, нагретый до 70-800 С. Предварительно шкаф необходимо простерилизовать.

ГОСТ Р 54653-2011 Удобрения органические. Методы микробиологического анализаСхема приготовления разведений и рассева суспензии микроорганизмов шпателем

Рисунок 16. Схема приготовления разведений и рассева суспензии микроорганизмов шпателем

Агаризованную среду можно подсушить, поместив чашки в термостат на 2—3 суток крышками вниз. После того как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2—4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1, 0,5 или 1 мл) суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 48—50° агаризованную среду, тщательно перемешивают и затем немедленно выливают в чашку Петри. Среде дают застыть. В случае глубинного посева обычно пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующим образом: по

1 мл из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2—4 стерильные чашки Петри. Затем заливают чашки 15—20 мл расплавленной и остуженной до 48—50° плотной средой и тщательно смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. Когда среда застынет чашки Петри помещают в термостат.

Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри с плотной средой после посева помещают в анаэростаты.

Подсчет выросших колоний

Колонии бактерий подсчитывают обычно через 3, колонии грибов и дрожжей — через 5—7, а колонии актиномицетов — через 7—15 суток инкубации в термостате.

Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства чернилами или карандашом по стеклу отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, подсчитывают число колоний в каждом секторе и результаты суммируют. Существуют специальные счётчики для подсчёта колоний (рис.17). Для подсчёта колоний чашкуПетри крышкой вниз помещают на стерильный столик (1), подсвечиваемый снизу, и подсчитывают колонии пером с пружинным острием (2). Остриём пера касаются дна чашки в участке, соответствующем положению колоний, и нажимают на перо. В результате на стекле остается метка, а держатель поднимается вверх, замыкая цепь, и показания счётчика увеличиваются на единицу. Затем острие пера поднимают над стеклом, пружина возвращает его в исходное положение, и цепь размыкается.

Счетчик для подсчета числа колоний микроорганизмов

Рисунок 17. Счетчик для подсчета числа колоний микроорганизмов

Лучшим разведением следует считать то, при высеве из которого на агаровой пластинке в чашке Петри вырастает от 30—50 до 100— 150 колоний. Если число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из данного разведения на одной чашке.

Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:

M=\frac{a\cdot 10^n}{V}, [6.3]

где

  • М - количество клеток в 1 мл,
  • а - среднее число колоний при высеве данного разведения,
  • 10 - коэффициент разведения,
  • n - порядковый номер разведения, из которого сделан высев,
  • V - объем суспензии, взятый для посева, в мл.

Метод посева в агаризованную среду осуществляют путем внесения в стерильную чашку Петри суспензии микроорганизмов из соответствующего разведения с последующим заливанием расплавленной и охлажденной до 450 агаризованной средой. Содержимое чашки перемешивают и дают среде застыть.

Метод посева в тонком слое предполагает внесение разведенной суспензии микроорганизмов в пробирки с небольшим объемом (2,5 –3,5 мл) расплавленной полужидкой агаризованной средой, которую затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшей агаризованной среды и дают застыть верхнему слою.

Каждый из вышеперечисленных методов посева имеет свою область использования и определенные ограничения. При посеве на поверхность агаризованной среды все выросшие колонии являются поверхностными. Именно в этом случае изучают характерные изменения в индикаторных агаровых средах. При посеве в агаризованные среды колонии, как правило, компактны и невелики по размерам, так как формируются под слоем агара, что дает возможность учета большего их количества. Вторым преимуществом метода является возможность дополнительных манипуляций с составом среды: верхний и нижний слой могут содержать разные питательные добавки. Кроме того, к верхнему слою могут быть добавлены красители для облегчения обнаружения колоний.

Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)

Метод нашел широкое применение для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не развиваются на плотных питательных средах. Этим же методом пользуются при определении численности бактерий, относящихся к той или иной физиологической группе. Сущность метода предельных разве-дений состоит в следующем. В пробирки с жидкой средой вносят строго из-меренный объём из различных разведений исследуемого субстрата (рис.18). После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался или от-сутствовал рост, рассчитывают по таблицам наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл исходного субстрата. Необходимо отметить, что опреде-ление численности клеток чашечным методом обеспечивает большую точность по сравнению с методом предельных разведений.

Схема проготовления разведения и посев суспензии микроорганизмов в жидкую среду

Рисунок 18. Схема проготовления разведения и посев суспензии микроорганизмов в жидкую среду

Определение количества микроорганизмов методом предельных разведений включает приготовление разведений, посев в жидкую среду, регистрацию на-личия или отсутствия роста после инкубации и расчет наиболее вероятного числа клеток в единице объема исходного субстрата.

Приготовление разведений

Разведения исходной суспензии готовят точно так же, как и для чашечного метода.

Посев в среду и регистрация результатов

Питательную среду, благоприятную для развития микроорганизмов, численность которых хотят определить, предварительно разливают в пробирки (колбы) и стерилизуют. В пробирки (колбы) следует наливать одинаковый объем среды. Посев проводят из каждого разведения или из четырех-пяти последних, причем каждое разведение высе-вают в 3—5 параллельных пробирок. Количество посевного материала везде одинаково и, как правило, составляет 1 мл. Засеянные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблется от 3 до 10 суток и зависит от скорости роста микроорганизмов, численность которых определяют. После инкубации регистрируют рост микроорганизмов, используя различные показатели: помут-нение среды, образование пленки, осадка, газа или накопление в среде опреде-ленных продуктов метаболизма.

Наиболее вероятное количество клеток в единице объема рассчитывают по таблице Мак-Креди (табл. 4), разработанной на основании методов вариаци-онной статистики. Для этого первоначально составляют числовую характерис-тику, которая включает три цифры. Первая цифра слева показывает число про-бирок в том последнем разведении, при высеве из которого во всех засеянных пробирках был отмечен рост. Две следующие цифры обозначают число проби-рок, в которых отмечен рост микроорганизмов при засеве их из двух последу-ющих разведений. Затем по таблице находят наиболее вероятное число микро-организмов, соответствующее данному значению числовой характеристики. Количество микроорганизмов в 1 мл (1 г) исходного субстрата соответствует этому числу, умноженному на то разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.

Пример 1

Разведение исходной суспензии010-110-210-310-4
Число засеянных пробирок44444
Число пробирок, в которых обнаружен рост44310
Числовая характеристика431----
Наиболее вероятное число клеток микроорганизмов16,5----
Количество клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии165----

Пример 2

Разведение исходной суспензии10-210-310-410-510-6
Число засеянных пробирок33333
Число пробирок, в которых обнаружен рост33200
Числовая характеристика320----
Наиболее вероятное число клеток микроорганизмов9,5----
Количество клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии9,5103---

Таблица 4. Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объёма исходной суспензии (по Мак-Креди)

Числовая характеристика

Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок в числе

Числовая характеристика

Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок в числе

Числовая характеристика

Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок в числе

2

3

4

5

2

3

4

5

2

3

4

5

000

0,0

0,0

0,0

0,0

222

110

3,5

2,0

1,4

433

-

-

30,0

-

001

-

0,5

0,5

0,2

223

-

4,0

-

-

434

-

-

35,0

-

002

-

-

0,5

0,4

230

-

3,0

1,7

1,2

440

-

-

25,0

3,5

003

-

-

0,7

-

231

-

3,5

2,0

1,4

441

-

-

40,0

4,0

010

0,5

0,3

0,2

0,2

232

-

4,0

-

-

442

-

-

70,0

-

011

0,9

0,6

0,5

0,4

240

-

-

2,0

1,4

443

-

-

140,0

-

012

-

-

0,7

0,6

241

-

-

3,0

-

444

-

-

160,0

-

013

-

-

0,9

-

300

-

2,5

1,1

0,8

450

-

-

-

5,0

020

0,9

0,6

0,5

0,4

301

-

4,0

1,6

1,1

451

-

-

-

4,0

021

-

-

0,7

0,6

302

-

6,5

2,0

1,4

500

-

-

-

2,5

022

-

-

0,9

-

303

-

-

2,5

-

501

-

-

-

3,0

030

-

-

0,7

0,6

310

-

4,5

1,6

1,1

502

-

-

-

4,0

031

-

-

0,9

-

311

-

7,5

2,0

1,4

503

-

-

-

6,0

040

-

-

0,9

-

312

-

11,5

3,0

1,7

504

-

-

-

7,5

041

-

-

1,2

-

313

-

16,5

3,5

2,0

510

-

-

-

3,5

100

0,6

0,4

0,3

0,2

320

-

9,5

2,0

1,4

511

-

-

-

4,5

101

1,2

0,7

0,5

0,4

321

-

15,0

3,0

1,7

512

-

-

-

6,0

102

-

1,1

0,8

0,6

322

-

20,0

3,5

2,0

513

-

-

-

8,5

103

-

-

1,0

0,8

323

-

30,0

-

-

520

-

-

-

5,0

110

1,3

0,7

0,5

0,4

330

-

25,0

3,0

1,7

521

-

-

-

7,0

111

2,0

1,1

0,8

0,8

331

-

45,0

3,5

2,0

522

-

-

-

9,5

112

-

-

1,1

0,8

332

-

110,0

4,0

-

523

-

-

-

12,0

113

-

-

1,3

-

333

-

140,0

5,0

-

525

-

-

-

15,0

120

2,0

1,1

0,8

0,6

340

-

-

3,5

2,0

524

-

-

-

17,5

121

3,0

1,5

1,1

0,8

341

-

-

4,5

2,5

530

-

-

-

8,0

122

-

-

1,3

1,0

350

-

-

-

2,5

531

-

-

-

11,0

123

-

-

1,6

-

400

-

-

2,5

1,3

532

-

-

-

14,0

130

-

1,6

1,1

0,8

401

-

-

3,5

1,7

533

-

-

-

17,5

131

-

-

1,4

1,0

402

-

-

5,0

2,0

534

-

-

-

20,0

132

-

-

1,6

-

403

-

-

7,0

2,5

535

-

-

-

25,0

140

-

-

1,4

1,1

410

-

-

3,5

1,7

540

-

-

-

13,0

141

-

-

1,7

-

411

-

-

5,5

2,0

541

-

-

-

17,0

200

2,5

0,9

0,6

0,5

412

-

-

8,0

2,5

542

-

-

-

25,0

201

5,0

1,4

0,9

0,7

413

-

-

11,0

-

543

-

-

-

30,0

202

-

2,0

1,2

0,9

414

-

-

14,0

-

544

-

-

-

35,0

203

-

-

1,6

1,2

420

-

-

6,0

2,0

545

-

-

-

45,0

210

6,0

1,5

0,9

0,7

421

-

-

9,5

2,5

550

-

-

-

25,0

211

13,0

2,0

1,3

0,9

423

-

-

17,0

-

551

-

-

-

35,0

212

20,0

3,0

1,6

1,2

422

-

-

13,0

3,0

552

-

-

-

60,0

213

-

-

2,0

-

424

-

-

20,0

-

553

-

-

-

90,0

220

25,0

2,0

1,3

0,9

430

-

-

11,5

1,5

554

-

-

-

100,0

221

70,0

3,0

1,6

1,2

431

-

-

16,5

3,0

555

-

-

-

180,0

432

-

-

20,0

4,0

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

  1. Провести посев суспензии бактерий на агаризованную питательную среду для определения количества жизнеспособных клеток методом Коха.
  2. Определить количество дрожжевых клеток в 1 г прессованных хлебопекарных дрожжей с помощью камеры Горяева

ТЕМА № 7. Возбудители бактериальных кишечных инфекций

Знание биологических особенностей возбудителей ОКИ, брюшного тифа, паратифов важно для понимания технологом и товароведом необходимости соблюдения санитарно-гигиенических требований, обеспечивающих исклю-чение инфицирование пищевых продуктов микроорганизмами-возбудителями пищевых отравлений.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Освоение микробиологической диагностики эшерихиозов, дизентерии, сальмонеллезов, брюшного тифа, паратифов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Морфологические, физиологические и экологические особенности эшерихий, шигелл, сальмонелл.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Приготовить препарат для микроскопирования кишечной палочки.
  2. Описать рост кишечной палочки на средах Эндо и Левина.

Эшерихии

Термином эшерихиозы обозначают группу инфекционных заболеваний, вы-зываемых микроорганизмами рода Escherichia. Более чем в 99 % случаев воз-будителем эшерихиозов является Escherichia coli (около 1 % инфекций этой группы вызывают Escherichia ferqusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vul-neris). Кишечные инфекции, занимающие ведущее положение в структуре эше-рихиозов, связаны с четырьмя различными группами E.coli: энтеротоксиген-ными (ЭТКП), энтероинвазивными (ЭИКП), энтеропатогенными (ЭПКП) и энтрогеморрагическими (ЭГКП) кишечными палочками. Штаммы этих групп различаются, прежде всего, по факторам патогенности, а также по клиническим проявлениям заболеваний, возбудителями которых они являются.

Энтеротоксигенные штаммы E.coli вызывают диарею с выраженным болевым синдромом за счет воздействия на ганглиозидные рецепторы энтероцитов про-дуцируемых микроорганизмами термолабильного и термостабильного энтеро-токсинов, что приводит к активизации аденилатциклазной системы, внутрикле-точному накоплению циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и, как след-ствие, секреции жидкости и электролитов в просвет кишечника.

Энтероинвазивные E.coli, имеющие значительное сходство с микроорганиз-мами рода Shigella по биохимическим и антигенным свойствам, а также прояв-лению вирулентности, способствуют развитию заболеваний, протекающих по типу острой дизентерии.

Энтеропатогенные эшерихии, группируемые в два класса на основе харак-тера взаимодействия с клеточными культурами Hep-2 и Hela, колонизируют эпителий слизистой оболочки тонкой кишки, вызывая возникновение эрозий на его поверхности. Наличие у микроорганизмов плазмидокодируемого О-поли-сахарида с молекулярной массой 54 мДа способствует антифагоцитарной устой-чивости возбудителей и развитию бактериемии.

В настоящее время в качестве самостоятельной группы выделяют так назы-ваемые энтероадгезивные или аутоагглютинирующиеся штаммы E.coli, однако их роль в развитии инфекций ЖКТ выяснена не до конца.

Лабораторная диагностика кишечных инфекций, вызванных E.coli, заключа-ется в выделении чистых культур возбудителя. В качестве образцов для иссле-дования используют фекалии, рвотные массы, мочу, гной, кровь, спинномозго-вую жидкость. При необходимости исследованию подвергают промывные воды, остатки пищи, смывы с рук персонала.

Колонии эшерихий имеют на среде Эндо круглую форму, ровный край, матовую поверхность и малиново-красный цвет без металлического блеска, за-висящий от способности культур расщеплять лактозу (рис. 19). На среде Левина колонии E.coli имеют темно-синий цвет.

Культура бактерии E.coli на среде Эндо

Рисунок 19. Культура бактерии E.coli на среде Эндо

Шигеллы

Термином бактериальная дизентерия (шигеллез) обозначают инфекционное заболевание с поражением, главным образом, толстого кишечника, вызываемое микроорганизмами рода Shigella. Этот термин был предложен Гиппократом для обозначения кровавого поноса. Это короткие (1-3 мкм) грамотрицательные палочки без спор и капсул. К настоящему времени известно 4 вида шигелл: S.dysenteriae, S.flexneri, S.boydii, S.sonnei. Заболевание контагиозно, что приво-дит к эпидемическим вспышкам. Особенно опасно появление больных дизен-терией в организованных коллективах. Шигеллы способны размножаться и накапливаться в пищевых продуктах, особенно молоке. Сохраняются во внешней среде относительно недолго. На овощах и фруктах- до 2 недель, в воде и почве – до 3 месяцев.

Сальмонеллы

Сальмонеллы — короткие грамотрицательные палочки с закругленными кон-цами, длиной 1,5-4 мкм. В большинстве случаев подвижные (перитрихи), спор и капсул не имеют. Род сальмонелл включает виды: S.enterica с семью основными подвидами и S.bongori, которые различаются по ряду биохимических призна-ков. Сальмонеллы устойчивы к низким температурам, к высушиванию, спо-собны длительно сохраняться в пищевых продуктах и окружающей среде. Возбудители брюшного тифа и паратифов — S.typhi, S.paratyphi A, S.paratyphi B, грамотрицательные палочки размером 1-3,5х0,5-0,8 мкм, перитрихи. Рост на бульоне сопровождается помутнением, на МПА образуются нежные круглые, гладкие полупрозрачные колонии диаметром 2-4 мм. На среде Эндо все коло-нии бесцветны (рис. 20), на висмут-сульфит-агаре — черные. Избирательная среда — желчный бульон.

Заболевание распространено повсеместно, ежегодно в мире регистрируется несколько миллионов случаев брюшного тифа.

Рост сальмонелл на среде Эндо

Рисунок 20. Рост сальмонелл на среде Эндо

ТЕМА № 8. Основы санитарной микробиологии

Будущему товароведу и технологу необходимо знание основ санитарной микробиологии.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Ознакомление студентов с основными методами санитарно-микробиологи-ческих исследований.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Основные понятия и термины санитарной микробиологии.
  2. Методы санитарно-микробиологических исследований объектов внешней среды.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Осуществлять отбор проб воды, воздуха, продуктов питания для после-дующего санитарно-бактериологического исследования.

Основные понятия и термины санитарной микробиологии

Объектами санитарно-микробиологического исследования являются вода, воздух, почва и другие объекты окружающей среды, а также пищевые продукты, оборудование пищеблоков и т.п.

По видовому составу биологические загрязнения подразделяется на:

  • загрязнения патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, цианобактериями и микроорганизмами, предназначенными для борьбы с насекомыми, микроорганизмами–продуцентами токсических веществ;
  • загрязнения биологическими веществами: антибиотиками, белками, ферментами, витаминами.

Наиболее существенными с точки зрения размера наносимого ущерба являются следующие биологические загрязнители:

  • хозяйственно-бытовые и сточные воды;
  • отходы животноводческих комплексов;
  • отходы промышленных предприятий по производству
  • антибиотиков, вакцин, сывороток, белков, витаминов,
  • ферментов и т.п.
  • массовое развитие в воде открытых водоемов сине-зеленых водорослей;

Для каждого вида загрязнения должны быть определены предельные допустимые концентрации (ПДК), т.е. такие, которые не влияют отрицательно на процессы самоочищения внешней среды, не подавляют санитарно-показательные микроорганизмы, не усиливают их патогенные свойства, не удлиняют сроки выживания микроорганизмов и не способствуют ухудшению здоровья людей.

Санитарная микробиология располагает двумя методами, с помощью которых можно определить санитарно-эпидемиологическое состояние внешней среды — прямое обнаружения патогенных микроорганизмов во внешней среде и косвенная индикация возможного их присутствия во внешней среде.

Первый метод является более надежным, но трудоемким и недостаточно чувствительным. Второй метод (косвенной индикации) более прост и доступен. Этот метод располагает двумя показателями — критериями, которые позволяют определить санитарно-эпидемиологическую ситуацию. К ним относят общее микробное число и концентрацию санитарно-показательных микроорганизмов.

Общее микробное число (ОМЧ) — это число всех микроорганизмов в 1 миллилитре — мл (см3) или в 1 грамме — (г) субстрата. При этом исходят из предположения, что чем больше микроорганизмов обнаруживается во внешней среде, тем вероятнее загрязнение внешней среды патогенными микроорганизмами.

ОМЧ определяют при контроле очистки воды, в том числе колодезной, проверке эффективности мойки посуды, воздуха в кондитерских цехах и т.п, определении показателя свежести скоропортящихся продуктов, исследовании почвы, при выборе места для строительства объектов питания. ОМЧ используют для определения характера микрофлоры. Если в пищевом продукте, прошедшем термическую обработку, обнаруживаются вегетативные формы микроорганизмов, то это свидетельствует о повторном заражении продукта после термической обработки или об ее неэффективности. Обнаружение спор подтверждает удовлетвортельную термическую обработку.

Термин санитарно-показательные микроорганизмы (СПМО) обозначает такие микроорганизмы, которые постоянно обитают в естественных полостях тела человека (животных) и постоянно выделяются во внешнюю среду.

Чем выше концентрация СПМО, тем больше вероятность присутствия патогенных микроорганизмов. Количество СПМО выражают в титрах и индексах.

Титр — это минимальное количество субстрата (в мл или г), в котором еще обнаруживаются СПМО.

Индекс — это количество СПМО, которое содержится в 1 л воды или в 1 мл другого субстрата.

Наиболее вероятное число (НВЧ) означает количество СПМО в 1 л для воды или в одном г (мл) для другого субстрата. Это более точный показатель, т.к. он имеет доверительные границы, в пределах которых может колебаться с вероятностью 95%.

Общая характеристика санитарно-показательных микроорганизмов

В качестве СПМО предложено довольно много микроорганизмов, их можно условно разделить на три группы:

  • Индикаторы фекального загрязнения (обитатели кишечника человека и животных);
  • Индикаторы воздушно-капельного загрязнения (обитатели верхних дыхательных путей);
  • Индикаторы процессов самоочищения (обитатели внешней среды).

Первая группа санитарно-показательных микроорганизмов

В действующих нормативно-технических документах по контролю за санитарно-бактериологическими показателями воды, пищевых продуктов, почвы предусмотрен учет БГКП.

БГКП — это грамотрицательные, не образующие спор, короткие палочки, сбраживающие глюкозу и лактозу с образованием кислоты и газа при 37°±0,5°С в течение 24–48 ч, не обладающие оксидазной активностью.

В настоящее время узаконена энтерококкометрия для молока, котлет с целью выяснения эффективности их термической обработки.

Протей

В настоящее время показано, что протей встречается в 98% случаев в выделениях кишечника человека и животных.

Обнаружение протея в воде и продуктах указывает на загрязнение объектов разлагающимися субстратами и свидетельствует о крайнем санитарном неблагополучии. При обнаружении протея в пищевых продуктах их бракуют, а воду не разрешают употреблять для питья.

Клостридиум перфрингенс

Клостридиум перфрингенс длительно сохраняется во внешней среде за счет спорообразования, поэтому обнаружение его не свидетельствует о свежем фекальном загрязнении. На эти бактерии губительно действует сопутствующая микрофлора, но их споры устойчивы к концентрациям активного хлора 1,2–1,7 мг/л воды. Такие дозы губительно действуют на энтеровирусы, поэтому клостридиум перфрингенс может служить косвенным показателем наличия в воде энтеровирусов.

Термофилы

Это целая группа СПМО, в основном споровых, растущих при температуре 55–60°С. Обитают во внешней среде и являются показателем загрязнения навозом и компостом. В России их определяют при исследовании почвы, а также в консервах, как индикатор термической обработки, особенно при хранении их в условиях жаркого климата.

Бактериофаги

В качестве СПМО используют бактериофаги кишечной палочки — колифаги, фаги сальмонелл и шигелл. Они обнаруживаются там, где есть соответствующие бактерии, к которым эти фаги адаптированы. Фаги выжи-вают во внешней среде более 9 месяцев.

Они ценны как показатель фекального загрязнения, особенно энтеровирусами, т.к. фаги выделяются из сточных вод с той же частотой, что и энтеровирусы.

Вторая группа санитарно-показательных микроорганизмов

Представители этой группы СПМО определяются в воздухе, в молочных продуктах, в воде. К ним относится a–зеленящий стрептококк (стрептококкус саливариус). Другим санитарно-показательным стрептококком является b–гемолитический стрептококк, он обнаруживается в 80% у людей и, в основном, страдающих воспалительными заболеваниями верхних дыхательных путей. Он обладает гемолитическими свойствами.

Показателем санитарного неблагополучия является и золотистый стафилококк.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы

Почва является важнейшей средой и природным резервуаром обитания микроорганизмов. Вместе с растениями и животными составляют сложные и многообразные биогеоценозы, состав, плотность, функциональная активность и прочие характеристики которых зависят от типа и структуры почвы, состава минеральных и органических веществ, физико-химического состояния, температуры, рН, влажности, концентрации углекислого газа, других факторов. В слое пахотной почвы толщиной 15 см на площади в 1 га может содержаться от 1 до 5-6 тонн микробной массы. Она максимальна на глубине 10-20 см. На глубине свыше 1-2 м микроорганизмы уже встречаются в незначительном количестве; начиная с глубины 5-6 м почва может быть стерильной.

Патогенные микроорганизмы чаще всего попадают в землю с испражнениями, мочой, гноем, мокротой, слюной и другими выделениями, через трупы людей и животных, погибших от инфекционных заболеваний. Патогенные и условно-патогенные микробы контаминируют почву при сбросе фекально-бытовых и сточных вод различных предприятий.

Сроки переживания патогенных для человека микробов в почве широко варьируют. Неспорообразующие бактерии – возбудители дизентерии, брюшного тифа, холеры, чумы, бруцеллеза, туляремии, туберкулеза – выживают в почве от нескольких дней до нескольких месяцев. Споры возбудителей столбняка, сибирской язвы, газовой гангрены могут сохраняться много лет. Более того, для спорообразующих бактерий рода Clostridium почва является естественной средой обитания.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы проводят с целью предупредительного санитарного надзора, текущего санитарного надзора и по эпидемическим показаниям. При проведении текущего санитарного надзора ограничиваются установлением факта и оценкой степени фекального загрязнения почвы. Почвы с преобладанием бактерий, свидетельствующих о фекальном загрязнении, рассматривают как санитарно неблагополучные. Для определения давности фекального загрязнения почвы определяют несколько санитарно-показательных микроорганизмов. Присутствие в почве определенных концентраций кишечной палочки (Е.coli) и фекального стрептококка (Streptoccocus faecalis) указывает на свежее фекальное загрязнение, бактерий родов Citrobacter и Епtеrоbасtеr — на несвежее, а Clostridium perfringens — на давнее фекальное загрязнение.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы с целью предупредительного надзора проводят по расширенному перечню показателей. Определяют коли-индекс – количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1 г почвы, перфрингенс-титр – наименьшую массу почвы в граммах, в которой обнаруживаются особи Clostridium perfringens, общую численность сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы.

Точечные пробы отбирают на пробной площадке из одного или нескольких слоев или горизонтов методом конверта. Выкапывается шурф 0,3 м x 0,3 м и глубиной 0,2 м. Поверхность одной из стенок шурфа очищают стерильным ножом. Затем из этой стенки вырезают почвенный образец, размер которого обусловлен заданной навеской, так, если необходимо отобрать 200 г почвы, размер образца 20 см x 3 см x 3 см, 500 г - 20 см x 5 см x 3 см. Точечные пробы отбирают ножом, шпателем или почвенным буром.

Объединенную пробу составляют путем смешивания точечных проб, отоб-

ранных на одной пробной площадке. Для бактериологического анализа с одной пробной площадки составляют 10 объединенных проб. Каждую объединенную пробу составляют из трех точечных проб массой от 200 до 250 г каждая, отобранных послойно с глубины от 0 до 5 см, от 5 см до 20 см. Времяот отбора проб до начала их исследования не должно превышать 1 суток.

Для приготовления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный, плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем. Перед посевом почву просевают через сито диаметром 3 мм.

Для учета почвенных микроорганизмов достаточно навески от 1 до 10 г. В навеску почвы добавляют небольшое количество стерильной водопроводной воды до получения пастообразного состояния почвы, растирая ее в течение 5 минут. Из суспензии делают раститровку. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде (колба), добавляя к суспензии стерильную водопроводную воду в соотношении 1: 9 к весу почвы (например: 1 г почвенной суспензии разводят в 9,0 мл стерильной водопроводной воды, 10 г почвы - в 90 мл воды и т.д.). Приготовленые разведения суспензируют на шейкере 10-20 мин. За это время оседают грубые минеральные частицы почвы.Для приготовления последовательно убывающих концентраций почвы, из первого разведения, находящегося во флаконе, с содержанием почвы 0,1 г (10 -1) отбирают стерильной пипеткой 1,0 мл и переносят в пробирку с 9,0 мл стерильной водопроводной воды. При этом получают второе

разведение, содержащее 0,01 г/мл (10-2 ) почвы. Повторяя эту операцию, доводят разведение почвы до 0,0001 - 0,00001 г/мл (10-4 - 10 -5). Для приготовления каждого разведения используют отдельные пипетки. Приготовленные разведения используются для посева на различные питательные среды.

Титрационный метод определения индекса БГКП в почве

Из первого разведения почвенной суспензии (1:10), прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой берут 10,0 мл, засевают во флаконы с 90,0 мл жидкой лактозо-пептонной среды (ЛПС) или среды Кесслера, что со-ответствует засеву 1 г почвы. Соотношение между навеской почвы или ее эквивалентным разведением и питательной средой 1:9, а для сред двойной концентрации - 1:1.

Посев меньших количеств (0,01 г, 0,001 г, то есть 10-2 , 10-3 и т.д.) делают по 1,0 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии в про-бирки с 9,0 мл тех же сред. Титрование проводят до разведения 1:1000000, то есть 10-6 с регулярной сменой пипеток при переходе от одного разведения к другому. Посевы инкубируют в течение 48 ч при 370 C, через 24 ч инкубации проводят предварительную оценку посевов.

Отсутствие газообразования и помутнения через 48 ч инкубации выдают окончательный отрицательный ответ. При наличии в посевах признаков роста: помутнения и газообразования или только помутнения - производится высев на поверхность среды Эндо.

Чашки с посевами помещают в термостат на 18 - 24 ч при температуре 37 0C. При отсутствии роста на чашках выдают отрицательный ответ. При наличии на поверхности среды Эндо розовых или красных колоний, малиновых с металлическим блеском или без него проводят микроскопию колоний с последующей постановкой оксидазного теста. Оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Еnterobacteriaceae от бактерий рода Pseudomonoas и других видов сапрофитных бактерий.

При наличии оксидазоотрицательных Гр - палочек по 2 -3 колонии каждого типа засевают параллельно в 2 пробирки в полужидкую или жидкую с поплавком среду с лактозой, разлитую в пробирки в количестве 4,0 - 5,0 мл, для подтверждения ферментации лактозы при температуре 37 0C. Учет производят через 18 ч инкубации. Если за это время происходит образование кислоты и газа, это свидетельствует о наличии бактерий группы кишечных палочек. Признаком газообразования является появление пузырьков газа, об образовании кислоты свидетельствует изменение цвета среды. При появлении только кислоты пробирки оставляют втермостате для окончательного ответа еще на 24 ч, при отсутствии газообразования через этот срок выдают окончательный отрицательный ответ, при появлении газообразования - положительный ответ. После выявления БГКП устанавливают титр, при этом принимается то предельное разведение почвы, в котором обнаруживаются колиформы.

Для перевода титра в индекс необходимо 1000 разделить на число, выражающее титр. Так, при титре 0,01 индекс равен 100, а при титре 0,1 индекс равен 10.

Определение C. perfringens в почве

Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.

Из приготовленных почвенных разведений (до 1:10-6 ), прогретых при температуре 75 0 C в течение 20 минут для исключения вегетативных форм, по 1,0 мл переносится в два параллельных ряда пробирок. Затем во все пробирки на-ливают по 9 – 10 мл горячего железосульфитного агара и прогретого до 70- 80 0C (среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков). Для создания анаэробных условий роста пробирки быстро охлаждают, помещая в емкости с холодной водой. Посевы инкубируют при 44 0C в течение 16 - 18 часов. При росте в среде черных крупных колоний (грамположительные, каталазоотрицательные) выдают положительный ответ о присутствии С. perfringens в 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическое исследование воды

Вода и почва, является естественной средой обитания разнообразных бактерий, грибов, вирусов, микроскопических водорослей, простейших. В водоемах различают собственную (аутохтонную) и заносную (аллохтонную) микрофлору, поступающую из почвы, воздуха, живых организмов. В воде, как и в почве, происходят биологические процессы очищения от несвойственной (аллохтонной) микрофлоры.

Концентрация водных микроорганизмов определяется содержанием в воде органических веществ. Наиболее чисты грунтовые подземные воды, так как после просачивания через почву большинство микробов задерживается в фильтрующем слое. Значительно больше микробов в открытых водоемах, что связано с высоким содержанием растворенных питательных органических веществ, которые поступают со сточными и канализационными водами, отходами предприятий. Вода имеет важное санитарно-эпидемиологическое значение как фактор передачи возбудителей многих инфекций, особенно кишечных, которые с испражнениями больных и носителей поступают в открытые водоемы, а оттуда нередко — и в питьевую воду.

Споры возбудителя сибирской язвы годами могут сохраняться в воде; месяцы переживают в воде сальмонеллы, лептоспиры, вирусы полиомиелита и гепатита А, меньше (дни, недели) выживают возбудители дизентерии, холеры, бру-целлеза, туляремии, условно-патогенные энтеробактерии. В теплое время года благодаря большей активности процессов самоочищения воды продолжитель-ность жизни бактерий короче, в холодной воде, соответственно, дольше. Во льду возбудители кишечных инфекций могут сохраняться в течение нескольких недель и месяцев.

Санитарно-микробиологическое исследование воды проводится с целью теку-щего надзора, то есть в плановом порядке, а также по специальным эпидемио-логическим показаниям.

Требования к качеству воды разных объектов, методы исследований и крите-рии оценки результатов представлены в нормативных актах – государственных стандартах (ГОСТ), санитарных правилах и нормах, методических указаниях.

Основными официально регламентированными показателями качества сани-тарно-микробиологического состояния воды в настоящее время являются:

  • общее микробное число (ОМЧ);
  • наиболее вероятное число колиформных бактерий;
  • наиболее вероятное число термотолерантных колиформных бактерий;
  • наличие спор сульфитредуцирующих клостридий;
  • количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) бактериофага E.coli.

При необходимости расследования водных вспышек инфекционных заболе-ваний проводят более детальное санитарно-микробиологическое исследование воды, определяя наличие энтерококков, сальмонелл, холерного вибриона, энтеровирусов.

Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками.

Отбор проб из крана производят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин при открытом кране. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок.

При отборе хлорированной воды в емкость до ее стерилизации вносят серноватистокислый натрий из расчета 18 - 20 мг на 500 см3 пробы сточной воды.

При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании. Срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 ч.

Определение общего микробного числа

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24. Исходную пробу воды титруют проводят до разведения 1:1000000, то есть 10-6 .

Из каждого разведения делают посев не менее двух объемов по 1 мл в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. После внесения воды в каждую чашку вливают (8—12) мл (на чашку диаметром 90—100 мм) расплавленного и остуженного до (45—49) °С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до застывания агара. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч. Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 изолированных колоний. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды (см. формулу 6.3).

Если на одной из 2 чашек подсчет невозможен, результат выдают на основании учета колоний на одной чашке. Если на двух чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность.

Определение числа бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

При исследовании питьевой воды из системы централизованного водоснабжения анализируют 333 мл, профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра. При исследовании питьевой воды децентрализованного водоснабжения анализируют не менее 100 мл воды. Каждую пробу воды профильтровывают не менее чем через три фильтра (например, можно фильтровать по 100, 10 и 1 мл). Объемы воды для посева выбраны правильно, если на 1 - 2-х фильтрах выросли изолированные колонии, среди которых не более 30 колоний относятся к бактериям группы кишечных палочек.

Для фильтрования используют мембранные фильтры со средним диаметром пор 0,45 мкм и размером 35 или 47 мм в диаметре (отечественные фильтры «Владипор» МФАС–0С–1, МФАС–0С–2, МФАС–МА (№ 4–6) или зарубежные — ISO 9000 или EN 29000), прибор для фильтрования под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 32 мм и с приспособлением для создания вакуума.Сухие стерильные мембранные фильтры перед фильтрованием смачивают в стерильной дистиллированной воде. Фильтры помещают на среду Эндо и термостатируют при (37 ± 2) °С в течение 18 - 24 ч.

При отсутствии какого-либо роста на фильтрах или при наличии только пленчатых, губчатых с неровной поверхностью и краями, плесневых и других не характерных для кишечных палочек колоний дают отрицательный ответ. Анализ на этом заканчивают через 18 - 24 ч.

При росте на фильтрах колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском и без него, красных, розовых слизистых, розовых с темным центром, бесцветных) выполняют оксидазный тест. Мембранный фильтр колониями вверх переносят на кружок фильтровальной бумаги, смоченной реактивом для определения оксидазной активности. Учитывая бактерицидность реактивов для определения оксидазной активности, мембранный фильтр сразу после проявления реакции следует перенести обратно на среду Эндо и не позднее 5 - 7 мин пересеять оксидазоотрицательные колонии в полужидкую среду с глюкозой (если это необходимо по дальнейшему ходу анализа). Наличие активной оксидазы (изменение цвета колоний на сине-фиолето-вый) у всех колоний, за исключением не характерных для БГКП, позволяет дать отрицательный ответ и закончить анализ через 18 - 24 ч.

Если выросли колонии, не обладающие оксидазной активностью, то из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Отсутствие в мазках грамотрицательных, не образующих спор палочек, позволяет дать отрицательный ответ и закончить анализ через 18 - 24 ч.

Если красные и темно-красные колонии с металлическим блеском и без него (лактозоположительные) образованы грамотрицательными палочками, не обладающими оксидазной активностью, то их число подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 мл воды. Вычисления проводят по формуле:

X=\frac{a\cdot 100}{v}

где:

  • х – число колоний в 100 мл;
  • v – объем воды, профильтрованной через фильтры, на которых велся учет;
  • а – число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.

В сомнительных случаях, когда нет уверенности, что колонии образованы бактериями, ферментирующими лактозу, а также при наличии на фильтрах розовых, розовых с центром, бесцветных колоний грамотрицательных и оксидазоотрицательных палочек, их подсчитывают (каждый тип колоний отдельно) и принадлежность к БГКП подтверждают посевом двух-трех изолированных колоний каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет производят через 4 - 5 ч инкубации посевов при 37 °С. При образовании кислоты и газа результат считают положительным, при отсутствии кислоты и газа - отрицательным. Анализ заканчивают через 24 - 28 ч. При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного учета газа через 24 ч.

Подсчитывают сумму лактозоположительных колоний и тех из лактозоотрицательных, которые ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа при 37 °С в течение 24 ч.

Титрационный метод определения бактерий группы кишечных палочек с использованием среды КОДА

Среда имеет в своем составе ингибитор, не требует строгой асептики и не теряет свойств под воздействием света. Ориентировочный ответ может быть дан по изменению цвета индикатора. Для посева 1 мл воды и ее разведений используют среду нормальной концентрации. Для посева 10, 50 и 100 мл воды используют соответствующие объемы среды двойной концентрации, увеличивая количество сухого препарата на тот же объем воды в 2 раза.

При исследовании питьевой воды централизованного водоснабжения засевают 3 объема по 100 мл, 3 объема по 10 мл и 3 объема по 1 мл. При исследовании питьевой воды децентрализованного водоснабжения засевают 1 объем по 50 мл, 5 объемов по 10 мл и 5 объемов по 1 мл. 100 и 10 мл воды вносят во флаконы и пробирки с 100 и 10мл концентрированной среды КОДА. 1 мл воды и 1 мл из разбавлений вносят в пробирки с 10 мл среды нормальной концентрации. Посевы инкубируют при 37 °С.

Результаты учитывают предварительно через 24 ч, окончательно - через 48 ч. Положительным считается появление мути и изменение цвета индикатора. Коли-индекс высчитывают по таблице 5.

Таблица 5. Таблица расчета наиболее вероятного числа микроорганизмов (расчет наиболее вероятного числа бактерий в 100 мл питьевой воды)

Число положительных результатов из:

НВЧ

Доверительный интервал (95%)

3 объемов по 100 мл

3 объемов по 10 мл

3 объемов по 1 мл

бактерий в 100 мл

нижний

верхний

1

2

3

4

5

6

0

0

1

0,3

0

1,4

0

0

2

*1

0

0

3

*

0

1

0

0,3

0,1

1,4

0

1

1

*

0

1

2

*

0

1

3

*

0

2

0

0,6

0,1

2,8

0

2

1

*

0

2

2

*

0

2

3

*

0

3

0

*

0

3

1

*

0

3

2

*

0

3

3

*

1

0

0

0,4

0,1

1,7

1

0

0

0,7

0,2

3,4

1

0

2

*

1

0

3

*

1

1

0

0,7

0,2

3,4

1

1

1

1,1

0,2

5,2

1

1

2

*

1

1

3

*

1

2

0

1,1

0,2

5,3

1

2

1

*

1

2

2

*

1

2

3

*

1

3

0

*

1

3

1

*

1

3

2

*

1

3

3

*

2

0

0

0,9

0,2

4,3

2

0

1

1,4

0,3

6,7

2

0

2

*

2

0

3

*

2

1

0

1,5

0,3

6,9

2

1

1

2

0,4

9,6

2

1

2

*

2

1

3

*

2

2

0

2

0,5

9,9

2

2

1

3

0,6

12,9

2

2

2

*

2

2

3

*

2

3

0

3

0,6

133

2

3

1

*

2

3

2

*

2

3

3

*

3

0

0

2

0,5

10,8

3

0

1

4

0,8

18,0

3

0

2

6

1,4

29,7

3

0

3

*

3

1

0

4

0,9

20,0

3

1

1

8

1,6

35,0

3

1

2

12

2,5

53,8

3

1

3

*

3

2

0

9

2,0

43,6

3

2

1

15

3,2

69,8

3

2

2

21

4,6

100,3

3

2

3

29

6,2

136,4

3

3

0

24

5,1

112,1

3

3

1

46

9,3

216,0

3

3

2

110

23,5

516,6

3

3

3

³ 240

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха

Недостаток влаги и питательных веществ, солнечная радиация препятствуют размножению микроорганизмов в атмосферном воздухе. Микробы поступают в воздух с поверхности почвы и растений, с отходами некоторых производств, из животных организмов. Микрофлора атмосферного воздуха зависит от интен-сивности солнечной радиации, ветра, осадков, характера почвы, времени года. При чихании, кашле, разговоре из верхних дыхательных путей человека в воздух выбрасывается множество капелек слизи с эпителиальными клетками и микроорганизмами.

Воздушно-капельным путем происходит передача возбудителей так назы-ваемых респираторных инфекций – гриппа и кори, туберкулеза, коклюша, дифтерии, краснухи, ветряной оспы, паротита. Микробный аэрозоль может стать причиной развития аллергических заболеваний, особенно при наличии в воздухе плесневых грибов и актиномицетов.

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха имеет целью контроль состояния воздушной среды закрытых помещений: холодильных камер, а также кондитерских цехов. Оно предусматривает определение общего содержания микроорганизмов и количества стафилококков в 1 м3 воздуха (табл. 5)

Таблица 5. Бактериологические показатели чистоты воздуха закрытых помещений

Оценка воздуха

Всего микробов

Стафилококков (зеленящих и гемолитических)

Летний период

Чистый

1500

16

Загрязненный250036

Зимний период

Чистый

4500

36

Загрязненный7000124

Существует несколько методов оценки состояния воздуха по СПМО.

Метод естественной седиментации или метод Коха

Осаждение микробных частиц и капель происходит под действием силы тяжести и нисходящих токов воздуха на поверхность плотной питательной среды в открытой чашке Петри.

Чашка Петри с МПА (для определения ОМЧ), кровяным агаром (для определения гемолитических стафилококков) или средой Сабуро оставляют открытыми на 5, 10, 15 мин и более. Затем их закрывают крышками и ставят в термостат перевернув их вверх дном. Посевы на чашках с МПА и кровяным агаром выдерживают при 30—37°С в течение 48 ч, на среде Сабуро — при температуре не выше 24-26°С 6-8 сут., а затем проводят подсчет выросших колоний.

По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха, пользуясь правилом Омельянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100 см2 в течение 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Каждая микробная клетка дает начало одной колонии. Зная количество выросших колоний и время экспозиции, вычисляют количество микробов, содержащихся в 1 м3 (1000 л) воздуха.

Аспирационный метод с использованием аппарата Кротова

Определение микробного загрязнения воздуха аспирационным методом осуществляют с помощью пробозаборников инерционного типа - импактора или прибора для бактериологического анализа воздуха (щелевой аппарат Кротова, отсюда еще одно название метода: щелевой метод улавливания бактерий). В основу действия прибора положен принцип удара струи воздуха о поверхность питательной среды, которая помещается в чашке Петри.

При использовании аппарата Кротова воздух с помощью центробежного вентилятора всасывается через клиновидную щель, расположенную по радиусу над чашкой Петри. Диск, на котором закреплена чашка Петри, вращается со скоростью 1 оборот/сек, вследствие чего посев микроорганизмов происходит равномерно по всей поверхности питательной среды.

Местоположение и количество точек взятия проб воздуха определяют в зависимости от размеров помещения (см. метод седиментации). Чашку Петри с питательной средой помещают на диск прибора, тщательно закрывают крышку с помощью зажимов, установленных на его корпусе. Прибор включают в сеть, с помощью реометра устанавливают скорость движения воздуха - 25 или 40 л/мин. В среднем пробу воздуха отбирают в течение 10 мин со скоростью 25 л/мин.

После взятия пробы воздуха (из каждой определенной точки на две параллельные чашки Петри с МПА и средой Сабуро), чашки закрывают крышками и помещают в термостат. Питательные среды, температурный режим и время инкубации посевов такие же, как при исследовании воздуха методом седиментации (см. выше).

Учет результатов

Расчет осуществляют по формуле:

X=\frac{a\cdot x \cdot 1000}{v}

где

  • X - число микроорганизмов в 1 м3 воздуха;
  • а - количество колоний, которые выросли на чашке Петри после срока инкубации;
  • v - объем исследуемой пробы воздуха.

Аналогом аппарата Кротова является импактор «Флора-100» (рис. 21).

Импактор воздуха микробиологический

Рисунок 21. Импактор воздуха микробиологический

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

  1. Микрофлора почвы.
  2. Показатели фекального загрязнения почвы. Оценка санитарно-бактериологического состояния почвы.
  3. Микрофлора воды, степени микробного загрязнения воды.
  4. Оценка санитарно-бактериологического состояния воды.
  5. Микрофлора воздуха и его санитарно-бактериологическая оценка.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

  1. Изучить основные методы и показатели, необходимые для санитарно-бактериологической оценки объектов окружающей среды.
  2. Определить присутствие Е.соli на коже рук и предметах обихода методом смывов; сделать заключение.
  3. Определить микрофлору зубного налета на основании данных бактериологического исследования.

СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ

  1. В учебной комнате были оставлены открытыми две чашки Петри с питательным агаром, которые простояли в течение 60 мин. и были подвержены последующей инкубации в термостате при 37 °С. На следующий день число выросших колоний на обеих чашках составило 200 колоний. Как называется данный метод исследования воздуха? О чем свидетельствуют полученные результаты?
  2. Коли-титр почвы равен 0,9, перфрингенс-титр — 0,0009, индекс термофилов — более 1000. К какой категории следует отнести такую почву?

ТЕМА № 9. Санитарная микробиология пищевых продуктов. Пищевые токсикоинфекции и интоксикации

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Освоение студентами методов санитарно-бактериологического анализа пищевых продуктов, микробиологического анализа пищевых токсикоинфекций и интоксикаций, а также методов проведения смывов на пищеблоке; формирование умения правильно оценивать результаты этих исследований.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Методы санитарно-бактериологического анализа пищевых продуктов и проведения смывов на пищеблоках.
  2. Методы микробиологических исследований при пищевых токсикоинфекциях и интоксикациях.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Оценивать результаты этих исследований согласно существующим нормативным документам.

Санитарная микробиология мясных продуктов

Одним из важнейших условий защиты мяса от обсеменения микробами яв-ляется строгое выполнение всех требований ветеринарного надзора за живот-ными в предубойный период и соблюдение санитарно-гигиенического режима в процессе приготовления мясопродуктов.

Мясо здорового животного обычно стерильно, так как в физиологических условиях стенка кишечника непроницаема для микроорганизмов. Утомление, длительное голодание и болезни животных, предназначенных к убою, способ-ствуют нарушению физиологических барьеров и проникновению микроорга-низмов из кишечного тракта через кровеносную и лимфатическую системы в органы и ткани животных.

При горизонтальном обескровливании животных микроорганизмы могут проникать в венозную систему и распространяться по тканям.

Мясо для многих микроорганизмов является хорошим питательным суб-стратом, в котором они находят все необходимые для себя вещества – углерод, азот, витамины, минеральные соли. Помимо прижизненного инфицирования, мускулы могут обсеменяться микробами после убоя животного – при первич-ной обработке и разделке туш (особенно если повреждается кишечник) через инструменты, с рук и одежды рабочих, а также при транспортировании, хра-нении, разрубе в магазинах и т. д. Поэтому даже свежевыработанное мясо не является стерильным, и в нем (преимущественно на поверхности) содержится то или иное количество микроорганизмов.

Обсемененность свежевыработанного охлажденного мяса микроорганизмами может быть различной в зависимости от степени созревания мяса, темпера-турно-влажностного режима охлаждения, санитарно-гигиенических условий выработки и др. На 1 см2 поверхности насчитывают тысячи, десятки и сотни тысяч клеток. Состав микрофлоры разнообразен. Преимущественно это аэроб-ные и факультативно-анаэробные, бесспоровые, грамотрицательные палоч-ковидные бактерии родов Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Aeromonas, бактерии группы кишечной палочки и протея, коринеформные бактерии, мо-лочнокислые микрококки. В меньших количествах обнаруживают аэробные и анаэробные спорообразующие бактерии, дрожжи, споры плесеней. Среди этих микроорганизмов немало возможных возбудителей, провоцирующих порчу мяса, способных активно воздействовать на белки, жир и другие вещества, входящие в его состав.

Мясо может быть инфицировано и токсигенными бактериями, например, Clostridium perfringens, сальмонеллами, Bacillus cereus, энтерококками. Сальмонеллы нередко вызывают кишечные заболевания у рогатого скота, после чего животные длительно являются бациллоносителями. Проникновение саль-монелл в мышцы возможно при жизни животного. При значительном разм-ножении этих бактерий мясо может послужить причиной отравлений.

Мясные субпродукты (мозги, почки, сердце и др.) обычно более обсеменены микробами, чем мясо, и поэтому подвергаются более быстрой порче.

Бактериологическое исследование консервов

Консервы (от латинского conservo — сохраняю) — пищевые продукты, приготовленные из предварительно обработанного животного или раститель-ного сырья, укупоренные в жестяную или стеклянную тару и подвергнутые стерилизации в целях предохранения их от порчи при длительном хранении.

Консервы подразделяются на три основные группы: собственно консервы (полные консервы), полуконсервы и пресервы. К первой группе относятся консервы, микробиологическая стабильность которых не зависит от продол-жительности хранения при температуре, указанной на данный вид продукции.

Полуконсервы (мясные, ветчинные, шпик, сосиски) стерилизуют при 100-110 0С. Их безопасность и сохранность гаранитируются при темпераратуре от 2 до 15 0С.

Продукты, консервированные без применения термической стерилизации, принято называть пресервами (от французского рrеserver — предохранять). Они могут храниться лишь короткое время и только при пониженной температуре (не ниже 0 °С и не выше 5 °С).

Использование высокой температуры является одним из наиболее распро-страненных способов консервирования пищевых продуктов. Стерилизации обычно подвергают консервы мясные, мясорастительные, рыбные, консервы для диетического питания, соки овощные и др. Такие консервы при их правильной стерилизации и герметичности тары могут сохраняться годами.

Существуют и другие способы консервирования (пастеризация, заморажива-ние, сушка, соление, маринование, квашение, копчение, путем применения сахара, антибиотиков, химически чистых антисептиков и ряд других), которые направлены либо на уничтожение микроорганизмов, либо на временное прекра-щение их жизнедеятельности (например, путем высушивания).

Стерилизацию консервов производят в автоклавах под давлением. Уровень температуры и длительность ее воздействия устанавливают в зависимости от размеров тары, вида продукта, его кислотности, жирности, консистенции и других факторов. Важное значение имеет уровень микробной обсемененности консервируемого продукта, который перед стерилизацией не должен быть выше допустимого предела. Консервы в стеклянных банках стерилизуют при меньшей температуре, но более длительное время по сравнению с консервами в жестяной таре. Обычно стерилизацию продолжают в течение 40-90 мин. при температурах от 108 °С до 120 °С.

В промышленности лишь для консервов особого назначения добиваются абсолютной стерильности, для большинства же консервов требуется промышленная стерильность.

Критериями безопасности консервированных пищевых продуктов (промышленная стерильность) является отсутствие в консервированном продукте микроорганизмов, способных развиваться при температуре хранения, установленной для конкретного вида консервов, а также микроорганизмов и микробных токсинов, опасных для здоровья человека.

Остаточная микрофлора консервов представлена главным образом споро-образующими формами микробов. Среди них чаще всего встречаются как аэробные микроорганизмы - В. subtilis, В. mesentehcus, так и анаэробные - С. sporogenes, С. putrificus и др. Значительную долю остаточной микрофлоры консервов составляют термофильные микробы. Некоторые из них в процессе своей жизнедеятельности образуют газообразные продукты и вызывают порчу консервов со вздутием банок – бомбаж. Другие не дают газообразования и вызы-вают так называемую плоскокислую порчу.

Следует различать бомбаж биологического, химического и физического происхождения.

Биологический бомбаж вызывается газами, образующимися в результате размножения микроорганизмов. Под влиянием их жизнедеятельности происходит разложение белков, жиров и углеводов с образованием газов (H2S, NH3, C02), которые давят на стенки и донышки банки и вызывают ее вздутие. Биологический бомбаж чаще всего вызывается спорообразующими анаэробами и некоторыми термофильными бактериями. Иногда в этом процессе принимают участие факультативные анаэробы Е coli, P. vulgaris и др. Бомбаж фруктовых и молочных консервов нередко бывает обусловлен дрожжами.

Биологический бомбаж с санитарно-гигиенической точки зрения наиболее опасен. Консервы с биологическим бомбажем непригодны в пищу, подлежат браковке и уничтожению, независимо от того, каким видом микроорганизма вызван бомбаж.

Химический, или водородный, бомбаж возникает в результате сильной коррозии металла под влиянием кислого содержимого банки. При взаимодействии кислоты с металлом выделяется газообразный водород, давление которого приводит к изменению внешней формы банок.

Для предотвращения химического бомбажа продукты с повышенной кислот-ностью укладывают в жестяные банки, покрытые с внутренней поверхности специальным кислотоупорным лаком. Консервы с химическим бомбажем практически безвредны, но они не должны выпускаться для реализации в торговую сеть, поскольку невозможно на складах достоверно дифференцировать этот вид бомбажа от бомбажа биологического происхождения.

Физический бомбаж либо является результатом переполнения банки кон-сервированным продуктом, либо обусловлен подмораживанием консервов и расширением содержимого банок вследствие образования в них льда. Фи-зический бомбаж бывает и при вполне доброкачественных консервах, однако реализация их требует осторожности. При подмораживании имеет место обычно массовый бомбаж, но выявить в таких партиях консервов отдельные банки, вздутие которых произошло под влиянием опасных микроорганизмов, невозможно. Консервы с физическим бомбажем вследствие замораживания должны реализоваться только после предварительной варки.

Высокая температура в значительной степени ослабляет остаточную микро-флору, однако последняя может проявить жизнедеятельность через некоторое время, особенно при неправильном хранении консервов.

Эффективным способом контроля доброкачественности консервов является термостатная выдержка. Перед микробиологическим анализом консервы выдерживаются в термостатах от 5-7 до 15 суток при 37°С. Рыбные консервы в масле (шпроты, треска, корюшка и пр.) не подлежат термостатной выдержке. Последняя может способствовать активизации стафилококков, которые вследствие плохой теплопроводности масла иногда сохраняются при термической обработке. Известно, что развитие стафилококков не сопровождается газообразованием, поэтому банки, в содержимом которых стафилококк размножился, выглядели бы нормально, т.е. не вздутыми.

Консервы исследуют на промышленную стерильность, для выявления возбудителей порчи и патогенной (токсигенной) флоры.

Бактериологическое исследование консервов производится при строгом соб-людении правил асептики в стерильном боксе. Банку перед вскрытием тща-тельно протирают водой, затем ватой, смоченной спиртом. Ватный тампон под-жигается в пламени горелки и накладывается на крышку банки. Под горящий тампон подводят острие профламбированного металлического пробойника, прокалывают крышку и, вращая пробойником, расширяют отверстие до 1-1,5 см в диаметре. Взятие образца для посева производят с помощью стеклянной трубки диаметром 7-9 мм, предварительно проверенной на стерильность.

Для выявления мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в пробирки с мясопептонным бульоном с глюкозой вносят пробы консервированного продукта. Посевы выдерживают при 37°С в течение 5 сут. Посевы для выявления термофильных микроорганизмов инкубируют при 55-62сС. За признаками роста наблюдают ежедневно. При появлении помутнения, образовании пленки, выделении пузырьков газа содержимое пробирок микроскопируют и делают пересев в случае необходимости.

Мезофильные бациллы из группы В. subtilis (В. subtilis, В. pumilus, В. licheniformis) выделяют в посевах газа, имеют форму палочек со спорами, положительно или вариабельно окрашиваются по Граму и образуют каталазу.

При отрицательных результатах роста в посевах мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов делают вывод об отсутствии активно развивающихся микроорганизмов этой группы.

Обнаружение в посевах признаков роста микроорганизмов, отличных от бактерий группы В. subtilis, указывает на присутствие другой микрофлоры. В таком случае отмечают характер роста на питательной среде, морфологию клеток (кокки, грамотрицательные палочки, грамположительные неспорообразующие палочки), отношение к каталазе.

Для обнаружения мезофильных анаэробных микроорганизмов производят посев консервированного продукта в среду Китта-Тароцци. Термостатируют посевы при температуре 37°С в течение 5 сут.

Развитие мезофильных анаэробных микроорганизмов в посевах сопровож-дается помутнением среды, выделением газа, появлением постороннего запаха, в некоторых случаях разложением кусочков мяса или печени. В мазках облигатно-анаэробных бактерий присутствуют палочки, окрашивающиеся положительно по Граму и образующие споры.

Санитарно-микробиологическое исследование молока и молочных продуктов

Молоко является весьма благоприятной питательной средой для развития многих микроорганизмов. Различают специфическую и неспецифическую микрофлору молока и молочных продуктов.

К специфической микрофлоре молока и молочных продуктов относят микробов-возбудителей молочнокислого, спиртового и пропионовокислого брожения. Микробиологические процессы за счет жизнедеятельности этих микроорганизмов лежат в основе приготовления кисломолочных продуктов (творога, кефира, простокваши, ацидофилина и др.).

Бактерии молочнокислого брожения считаются нормальной микрофлорой молока и молочных продуктов. Главную роль при скисании молока и молочных продуктов играют молочнокислые стрептококки S.lactis, S.cremaris и другие. В группу молочнокислых бактерий также входят молочнокислые палочки: Lactobacterium bulgaricum, Lactobacterium casei, Lactobacterium acidophilus и т. д.

Основными возбудителями спиртового брожения в молоке и молочных продуктах являются дрожжи (Saccharomyces lactis и др.).

Неспецифическую микрофлору молока составляют гнилостные бактерии (Proteus), аэробные и анаэробные бациллы (В.subtilis, В.megatherium, C.putrificum) и многие другие. Ряд инфекционных заболеваний, таких как дизентерия, бруцеллез, лихорадка Q могут передаваться через молоко.

Плохие условия хранения молока также могут способствовать дальнейшему нарастанию в нем микрофлоры.

Санитарно-микробиологическое исследование смывов с объектов внешней среды

Данные санитарно-микробиологического исследования дают возможность объективно оценить санитарно-гигиеническое состояние обследуемых объектов, выявить нарушения санитарного режима и оперативно проводить целенаправленные мероприятия по их устранению.

Санитарно-микробиологические исследования проводят:

  • при текущем санитарном надзоре за продовольственными объектами;
  • по эпидемиологическим показаниям (при расследовании пищевых отравлении и случаев инфекционных заболеваний);
  • при контроле качества дезинфекции.

Различают несколько способов отбора проб с различного оборудования и инвентаря для микробиологического исследования: способы тампонных смывов, отпечатков, агаровой заливки. Из них наиболее часто используют способ тампонных смывов.

Санитарно-микробиологический контроль основан на обнаружении в смывах бактерий группы кишечных палочек (БГКП)– показателей фекального загрязнения исследуемых предметов. Исследования на стафилококк, патогенные бактерии семейства кишечных, определение общей микробной обсемененности проводят по показаниям. Например, взятие смывов для обнаружения стафилококков необходимо при обследованиях кондитерских цехов, молочных кухонь предприятий общественного питания.

Организация лабораторного контроля за объектами питания и торговли состоит из четырех этапов: подготовительного, этапа проведения обследования, этапа оценки полученных результатов и, в случаях обнаружения нарушений режима, этапа принятия срочных мер по их устранению. Тщательное соблюдение санитарных норм исключает возможность обсеменения предметов БГКП, поэтому факт их обнаружения в смывах является свидетельством нарушения санитарного режима.

Периодичность проведения смывов и их объем определяются конкретной санитарно-эпидемиологической обстановкой. Центры Роспотребнадзора осуществляют лабораторное исследование смывов и контролируют методику их взятия.

Особое внимание уделяется контролю бактериальной загрязненности обору-дования и инвентаря, используемого в процессе производства продукции, не подвергающейся в дальнейшем тепловой обработке (в холодном цехе). Аппаратуру и оборудование подвергают микробиологическому контролю после мойки и дезинфекции (хлорирования или пропаривания) непосредственно перед началом работы.

Взятие смывов производится с помощью стерильных ватных тампонов, закрепленных на палочках и вмонтированных в пробирки со стерильным раствором. Смывы с крупного оборудования‚ инвентаря берут с помощью трафарета площадью 25 см2 . Трафарет накладывается 4 раза в разных местах объекта, чтобы площадь поверхности смыва составила 100 см2 . Тампоны помещают в пробирку с 10 мл стерильной воды (или физиологического раствора), откуда после тщательного перемешивания делают посевы по 1 мл в среду Кесслер и в случае необходимости на общее количество бактерий. Количество выросших колоний умножают на 10 для получения характеристики микробиоты на 100 см2 поверхности.

При взятии смывов с посуды или мелкого инвентаря одним тампоном протирают по три одинаковых предмета — три тарелки, три стакана, три ложки и т. п. Влажным тампоном обтирается вся рабочая или внутренняя поверхность предметов. При взятии смывов с тарелок протирают всю внутреннюю поверхность, у стаканов протирают внутреннюю поверхность и верхний наружный край не менее 2 см, у столовых приборов протирают их рабочую часть.

Смывы берутся с рук, одежды и личных полотенец персонала, работающ-его в холодном и кондитерском цехах, на раздаче и других местах работы с готовыми к употреблению продуктами и пищей.

Одним тампоном протирают ладонные поверхности обеих рук, ногти и подногтевые ложа, а также межпальцевые промежутки. По каждой ладони и пальцам тампоном проводят не менее пяти раз.

На санитарной одежде тампоном протирают 4 участка площадью 25 см2 — сверху и посередине передней части одежды и на нижних частях рукавов. С полотенца берут смывы с четырех различных мест площадью по 25 см 2 каждое.

Пищевые токсикоинфекции и интоксикации

Пищевые отравления — острые, реже хронические, не контагиозные заболевания, возникающие в результате употребления пищи, массивно обсемененной определенными видами микроорганизмов или содержащей токсичные для организма вещества микробной или немикробной этиологии.

Выделяют следующие виды пищевых отравлений:

  • микробные отравления, которые подразделяются на тосикоинфекции и интоксикации или токсикозы (бактериальные и микотоксикозы смешанной этиологии);
  • немикробные отравления, которые включают в себя отравления ядовитыми растениями и тканями животных (ядовитыми по своей природе), отравление продуктами растительного или животного происхождения (ядовитыми при определенных условиях), отравление химическими веществами;
  • отравления неустановленной этиологии.

В соответствии с действующими документами важным является правильный отбор материала при расследовании пищевых отравлений. В качестве такого материала могут служить: остатки пищи, исходные продукты, суточные пробы (при сохранении их на холоде), рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения, моча, кровь для гемокультуры и серологических исследований (8-10 мл), слизь из зева и носа, у работников питания смыв из гнойничков на руках, широкий отбор смывов с разных предметов, соскобы, где их можно взять, питьевая вода, патологоанатомический материал.

Проба опечатывается и отправляется в лабораторию сразу же после взятия, а если необходимо хранение, то при 4-6 0С, но не более 24 ч. В сопроводительном документе описываются эпидемиология, клиника, подозрительный продукт с тем, чтобы его исследовать в первую очередь.

В разных странах в этиологии пищевых отравлений преобладают различные микроорганизмы. Так, например, в России — стафилококки, в Англии — сальмонеллы, в Америке — стафилококки, в Японии — галофильные вибрионы и т. д.

Около половины штаммов золотистого стафилококка -S.aureus продуцируют токсины, которые попадая в пищеварительный тракт, вызывают острейший гастроэнтерит с тяжелой рвотой и профузным поносом. Это наиболее распро-страненная пищевая интоксикация бактериальной природы.

На кровяном агаре стафилококки образуют гемолитические и негемолити-ческие непрозрачные колонии средних размеров белого или золотистого цвета, гладкие, круглые, с ровными краями, диаметром 1-3 мм.

Колонии стафилококков могут быть окружены зоной гемолиза и в большинстве случаев обладают золотистым, палевым или лимонно-желтым пигментом. На среде желточно-солевом агаре вырастают колонии, окруженные видимым при косом освещении радужным венчиком.

Шигеллы и сальмонелы также являются причиной пищевых отравлений, но в классификацию не вошли, поскольку учитываются как самостоятельные заболевания. Значителен процент пищевых отравлений неясной этиологии ( от 22 до 60 %).

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

  1. ГОСТ, которым предусмотрено бактериологическое исследование мяса.
  2. Порядок отбора образцов мяса для анализа.
  3. Микрофлора мяса, причины его обсеменения микроорганизмами.
  4. Методы бактериологического контроля качества мяса.
  5. Бактериологический контроль качества консервов.
  6. Правила отбора проб консервов.
  7. Методы бактериологического исследования консервов.
  8. Микрофлора молока и санитарно-бактериологические показатели качества молока.
  9. Методы санитарно-бактериологического исследования молока.
  10. Санитарно-бактериологический контроль предприятий питания и водоснабжения.
  11. Определение понятий «пищевая токсикоинфекция» и «интоксикация микробной этиологии».
  12. Общая характеристика возбудителей пищевых токсикоинфекций.
  13. Правила отбора проб и доставки их в лабораторию.
  14. Общая характеристика возбудителей пищевых токсикоинфекций.
  15. Схема и методы микробиологической диагностики пищевых токсикоинфекций.
  16. Основные виды пищевых интоксикаций микробной этиологии.
  17. Лабораторная диагностика пищевых интоксикаций микробной этиологи.

РАБОТА ПОД РУКОВОДСТВОМ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ

Во время самостоятельной работы преподаватель осуществляет контроль за соблюдением правил, взятием образцов, а также за техникой выполнения посевов.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

Для подготовки мяса к санитарно-бактериологическому исследованию необходимо: стерильно взятые навески (25-30г) перед посевом гомогенизировать в размельчителе тканей с небольшим количеством 0,1% пептонной воды в соотношении примерно 1:5. При отсутствии гомогенизатора кусочки мяса растирают в стерильной ступке с песком и стерильной водой. Взвесь после ее приготовления отстаивают 15 мин., после чего для исследования используют надосадочную жидкость.

  • приготовить мазки-отпечатки с поверхности и среза мяса, окрасить их по Граму, провести бактериоскопию, определить категорию мяса по свежести; ход исследования и результаты запротоколировать в тетрадь лабораторных занятий;
  • подготовить взвесь мяса и произвести ее посев в среду обогащения, среду Мюллера (20 мл взвеси в 50 мл среды во флаконе) и на чашку Петри со средой Эндо;
  • посев кусочков отварного мяса по Шукевичу производится с целью индикации бактерий рода Proteus; небольшой кусочек мяса вареного аккуратно, стараясь не задеть агар, помещают в конденсационную воду свежескошенного агара; посев инкубируют при 37оС в течение 48 часов - первый просмотр производится через 24 часа инкубации.

После обработки поверхности и вскрытия консервов содержимое банки вносят по 2 мл в 2 пробирки с сахарным бульоном для выявления мезофильных аэробов и в 2 пробирки со средой Китт-Тароцци для выявления мезофильных анаэробов. Перед посевом среду Китт-Тароцци прогревают 25 мин. в кипящей водяной бане и затем быстро охлаждают до 30-40оС. Инкубируют при 37оС - 5 суток.

Производят посев молока пастеризованного в среду Кесслера для определения коли-титра. Засевают: по 1 мл молока в 3 пробирки с 9 мл среды Кесслера и по 0,1 мл молока в 3 пробирки с той же средой (т.е. получаем разведение 10-1 молока). Посевы инкубируют при 43оС в течение 18-24 часов.

Ход исследования заносится в тетрадь протоколов.

Взятие смыва с поверхности стола для санитарно-бактериологического исследования: смывы производят стерильными увлажненными тампонами (увлажняют физиологическим раствором или 0,1 % пептонной водой);

При взятии смывов с мелких предметов (ложки, тарелки) одним тампоном протирают всю поверхность 2-3 одноименных предметов.

При исследовании рук смывы делают с ладонных поверхностей (проводя по каждой ладони не менее 5 раз), пальцев, ногтей, межпальцевых поверхностей.

Смывы со спецодежды производят с площади 100 см2, включая прежде всего нижние части каждого рукава и передние части одежды.

После взятия смыва тампон помещают в пробирку с жидкой питательной средой. На каждой пробирке отмечают порядковый номер, под тем же номерам заносят в список название предмета, с которого сделан смыв. Пробирки с посевами и список доставляют в лабораторию в тот же день. Обтирают тампон о внутренние стенки пробирки и переносят тампон и содержимое пробирки в пробирку со средой Кесслера или КОДА.

Инкубация в термостате при 37оС в течение 24 часов.

Студенты изучают схему диагностики пищевых отравлений и интоксикаций.

СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ

  1. Зарегистрирована вспышка пищевого отравления, связанная с потреблением кондитерских изделий, которые хранились при комнатной температуре и при изготовлении которых использовали утиные яйца. Какие микроорганизмы могли послужить причиной этого заболевания?
  2. В посевах консервов на 3-й день исследования обнаружен рост микроорганизмов в сахарном бульоне. Каковы ваши дальнейшие действия?

Тестовые задания

  1. Основные морфологические разновидности бактерий:
    1. Кокки
    2. Палочки
    3. Извитые
    4. Все вышеуказанное верно
  2. Обязательной структурой бактериальной клетки является
    1. Клеточная мембрана
    2. Аппарат Гольджи
    3. Ядро
    4. Нуклеоид
  3. Выберите правильный ответ. Увеличение иммерсионного объектива равно:
    1. 7
    2. 40
    3. 90
    4. 120
  4. Выберите правильный ответ. Споры необходимы бактериям для
    1. Размножения
    2. Сохранения во внешней среде
    3. Подвижности
    4. Распространения во внешней среде
  5. Выберите правильный ответ. Жгутики необходимы бактериям для:
    1. Размножения
    2. Движения
    3. Сохранения во внешней среде
    4. Дыхания
  6. Выберите правильный ответ. Признаки грамположительных бактерий:
    1. Не окрашиваются
    2. Окрашиваются по Грамму в красный цвет
    3. Окрашиваются по Граму в синий цвет
    4. Окрашиваются в зеленый цвет
  7. Выберите правильный ответ. Признаки грамотрицательных бактерий:
    1. Не окрашиваются
    2. Окрашиваются по Граму в красный цвет
    3. Окрашиваются по Граму в синий цвет
    4. Окрашиваются в зеленый цвет
  8. Извитые бактерии:
    1. Актиномицеты
    2. Спириллы
    3. Микобактерии
    4. Все вышеуказанное неверно
  9. Выберите правильный ответ. Эукариоты -это:
    1. Простейшие
    2. Бактерии
    3. Грибы
    4. Прионы
  10. Выберите правильный ответ. Микроорганизмы, не имеющие клеточного строения:
    1. Бактерии
    2. Простейшие
    3. Грибы
    4. Вирусы
  11. При культивировании бактерий учитывают:
    1. Тип дыхания бактерий
    2. Питательные потребности бактерий
    3. Температурный режим
    4. Все вышеперечисленное верно
  12. Продуценты природных антибиотиков:
    1. Грибы
    2. Актиномицеты
    3. Бактерии
    4. Все вышеперечисленное верно
  13. Признаки дрожжей:
    1. Имеют ядро
    2. Размножаются делением пополам
    3. Не имеют клеточной стенки.
    4. Имеют капсулу
  14. Выберите правильный ответ. По отношению к кислороду микроорганизмы делят на группы:
    1. Аэробы
    2. Анаэробы
    3. Факультативные анаэробы
    4. Все вышеуказанное верно
  15. Ферменты – это:
    1. Продукты брожения
    2. Специфические катализаторы химических реакций
    3. Запасные питательные вещества
    4. Опорный каркас клетки
  16. Выберите правильный ответ. К методам стерилизации под действием температуры относятся:
    1. Тиндализация
    2. Пастеризация
    3. Автоклавирование
    4. Все вышеуказанное верно
  17. Продуктами микробиологического разложения белка являются:
    1. Птомаины
    2. Амины
    3. Вода
    4. Все верно
  18. Выберите правильный ответ. К пастеризации относится:
    1. Уничтожение спор микроорганизмов
    2. Нагрев вина, пива, соков до температуры 65-80 0 С в течение 10 -60 мин.
    3. Прогревание пищевых продуктов до температуры 600 в течение 10-60 мин.
    4. Обработка продуктов текущим паром
  19. Выберите правильный ответ. Сальмонеллы вызывают:
    1. Брюшной тиф
    2. Холеру
    3. Дизентерию
    4. Ботулизм
  20. К ботулизму относятся:
    1. Пищевая токсикоинфекция
    2. Палочка Clostridium botulinum
    3. Палочка Сlostridium tetani
    4. Сенная палочка
  21. Выберите правильный ответ. Для стерилизации пищевых продуктов, не переносящих нагревания, применяют:
    1. Автоклавирование
    2. Пастеризацию
    3. Стерилизацию сухожаровую
    4. Тиндализацию
  22. Выберите правильный ответ. Требования, предъявляемые к дезинфицирующим средствам:
    1. Хорошо растворяться в воде
    2. Не оказывать токсическое действие на людей и животных
    3. Достаточно долго сохранять бактерицидные свойства
    4. Все вышеуказанное верно
  23. Выберите правильный ответ. К дезинфицирующим средствам относятся:
    1. Галогенсодержащие вещества
    2. Глюкоза
    3. Поваренная соль
    4. Азот
  24. По типу питания микроорганизмы разделяются на:
    1. Автотрофы
    2. Галлофилы
    3. Сапрофиты
    4. Паразиты
  25. Выберите правильный ответ. В соответствии с требованиями СанПиНа в кисломолочных продуктах определяют:
    1. Общее микробное число
    2. Бактерии группы кишечной палочки
    3. Дрожжи
    4. Сенную палочку
  26. Выберите правильный ответ. Виды бомбажа консервов:
    1. Биологический
    2. Химический
    3. Физический
    4. Все вышеуказанное верно
  27. Выберите правильный ответ. Причиной биологического бомбажа является:
    1. Коррозия металла
    2. Жизнедеятельность микроорганизмов
    3. Переполнение банки консервированным продуктом
    4. Подмораживание
  28. Выберите правильный ответ. Бомбажные банки:
    1. Подлежат уничтожению
    2. Подлежат вторичной переработке с целью дальнейшего использования в пищу
    3. Дальнейшему хранению
    4. Бактериологическому исследованию
  29. Исследование консервов на промышленную стерильность заключается:
    1. В выделении аэробов и анаэробов
    2. В выделении стафилококка
    3. В выделении кишечной палочки
    4. В выделении сальмонелл
  30. Санитарно-показательные микроорганизмы –это:
    1. Микроорганизмы, которые постоянно обитают в естественных полостях тела человека и животных
    2. Не выделяются во внешнюю среду
    3. Не обитают в естественных полостях тела человека и животных
    4. Патогенные микроорганизмы
  31. Выберите правильный ответ. Бактерии группы кишечной палочки –это
    1. Грамотрицательные палочки
    2. Не образующие спор палочки
    3. Палочки, растущие при 370 С
    4. Все вышеуказанное верно
  32. Выберите правильный ответ. Титр
    1. это минимальное количество субстрата (в мл или г), в котором еще обнаруживаются санитарно-показательные микроорганизмы.
    2. это максимальное количество субстрата (в мл или г), в котором еще обнаруживаются санитарно-показательные микроорганизмы.
    3. это минимальное количество субстрата (в мл или г), в котором не обнаруживаются санитарно-показательные микроорганизмы.
    4. это максимальное количество субстрата (в мл или г), в котором не обнаруживаются санитарно-показательные микроорганизмы
  33. Выберите правильный ответ. Индекс
    1. - это количество, санитарно-показательных микроорганизмов, которое содержится в 1 л воды или в 1 мл другого субстрата.
    2. это количество, санитарно-показательных микроорганизмов, которое содержится в 1 мл воды.
    3. это максимальное количество субстрата (в мл или г), в котором не обнаруживаются санитарно-показательные микроорганизмы
    4. это минимальное количество субстрата (в мл или г), в котором не обнаруживаются санитарно-показательные микроорганизмы.
  34. Санитарно-показательные микроорганизмы в воде централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения
    1. Общие колиформные бактерии (ОКБ)
    2. Общее микробное число (ОМЧ)
    3. Споры сульфитредуцирующих клостридий
    4. Все вышеуказанное верно
  35. Выберите правильный ответ. Дезинфекция:
    1. это уничтожение во внешней среде только определенных возбудителей инфекционных заболеваний
    2. это уничтожение во внешней среде всех возбудителей инфекционных заболеваний
    3. это полное уничтожение во внешней среде всех микроорганизмов
    4. Все вышеуказанное верно
  36. Выберите правильный ответ. К дезинфицирующим веществам относятся
    1. Кислородсодержащие вещества
    2. Поверхностно-активные вещества
    3. Соединения тяжелых металлов
    4. Все вышеуказанное верно
  37. Выберите правильный ответ. Стерилизация:
    1. освобождение от всего живого, полное уничтожение в продуктах всех микроорганизмов и их спор
    2. это уничтожение во внешней среде всех возбудителей инфекционных заболеваний
    3. это полное уничтожение во внешней среде всех микроорганизмов
    4. это уничтожение во внешней среде только определенных возбудителей инфекционных заболеваний
  38. Выберите правильный ответ. К механическим методам стерилизации относится:
    1. Кипячение
    2. Фильтрование
    3. УФ-облучение
    4. Выхлопывание
  39. Выберите правильный ответ. Антибиотики – это:
    1. Дезинфицирующие вещества
    2. Вещества биологического происхождения
    3. Антисептики
    4. Все вышеуказанное верно
  40. Назначение питательных сред:
    1. Дифференциация бактерий по серологическим свойствам.
    2. Выделение простейших
    3. Для выделения чистой культуры искомых бактерий.
    4. Все вышеуказанное неверно
  41. Оптическая часть микроскопа состоит из:
    1. Тубуса
    2. Штатива
    3. Предметного столика
    4. Зеркала
  42. К механической части микроскопа относится:
    1. Тубус
    2. Конденсор
    3. Объектив
    4. Окуляр
  43. Выберите правильный ответ. Мясо-пептонный бульон – это среда
    1. Универсальная
    2. Специальная
    3. Дифференциально-диагностическая
    4. Элективная
  44. Выберите правильный ответ. Фитонциды:
    1. Это вещества, выделяемые высшими растениями и обладающие антимикробным действием
    2. Это вещества, выделяемые животными и обладающие антимикробным действием
    3. Это вещества, выделяемые бактериями и обладающие антимикробным действием
    4. Это вещества, выделяемые вирусами и обладающие антимикробным действием
  45. Особенности роста микроорганизмов на жидких питательных средах:
    1. Образуют пленку
    2. Образуют муть
    3. Образуют осадок
    4. Все вышеуказанное верно
  46. Выберите правильный ответ. Санитарно-показательные микроорганизмы, определяемые в воздухе:
    1. Общее микробное число
    2. Количество колоний стафилококка
    3. Количество плесневых и дрожжевых грибов
    4. Все вышеуказанное верно
  47. Выберите правильный ответ. Чтобы определить увеличивающую способность микроскопа надо?
    1. Сложить увеличение объектива и окуляра
    2. Умножить увеличение объектива и окуляра.
    3. Вычесть увеличение объектива из увеличения окуляра
    4. Все вышеуказанное неверно, есть другой способ определения.
  48. Выберите правильный ответ Кипячение - это метод:
    1. Стерилизации
    2. Дезинфекции
    3. Дератизации
    4. Дезинсекции
  49. Выберите правильный ответ. К простым методам окраски бактерий относится:
    1. Окраска одним красителем
    2. Отсутствие окраски
    3. Окраска двумя красителями
    4. Окраска тремя красителями
  50. Выберите правильный ответ. Тинкториальные свойства микроорганизмов:
    1. Восприимчивость к различным красителям
    2. Восприимчивость к различным антибиотикам
    3. Восприимчивость к различным дезинфектантам
    4. Способность расти на питательной среде
  51. Выберите правильный ответ. Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в синий цвет, поскольку:
    1. Имеют споры
    2. Имеют капсулу
    3. Имеют жгутик
    4. Имеют клеточную стенку, содержащую муреин.
  52. Бактерицидное действие химиопрепаратов - это
    1. Полное подавление роста микроорганизмов
    2. Отсутствие подавления роста микроорганизмов
    3. Задержка роста микроорганизмов
    4. Все вышеуказанное неверно.
  53. Бактериостатическое действие химиопрепаратов.
    1. Полное подавление роста микроорганизмов
    2. Отсутствие подавления роста микроорганизмов
    3. Задержка роста микроорганизмов
    4. Все вышеуказанное неверно.
  54. Увеличение сухого объектива равно:
    1. 7
    2. 10
    3. 40
    4. 90

Список литературы

  1. Бакунина Н.А, Краева Э.Л. Микробиология. – М.: Медицина, 1980.
  2. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии: уч.пособие для вузов – М.: Колос, химия, 2004.
  3. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2001.
  4. Воробьева П.И. Техническая микробиология.-М.: МГУ, 1987.
  5. Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология. –М.: Академия, 2003.
  6. Градова Н.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии.- М.: Дели принт, 2004.
  7. Егорова О. В. С микроскопом на «ты». – СПб.: Интермедика, 2000.
  8. Жарикова Г.Г., Козьмина О.А. Микробиология, санитария и гигиена пищевых продуктов.-М.: Гелан, 2001.
  9. Красильников А. П., Романовская Т. Р. Микробиологический словарь-справочник. – Минск: Асар, 1999.
  10. Лабинская А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований.- М.: Медицина, 2004.
  11. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: в 2 т. / Под ред. В. В. Зверева, М. Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010.
  12. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник / под ред. А. А. Воробьева. – М.: ООО «МИА», 2004.
  13. Медицинская микробиология: учебник / под ред. В. Б. Сбойчакова. – СПб.: ВМедА, 2006.
  14. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Общая микробиология.-М.:Академия, 2007.
  15. Промышленная микробиология / Под ред. М.С. Егорова – М.: Высшая школа, 1989.
  16. Сбойчаков В. Б. Санитарная микробиология. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.
  17. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии. – М.: Дрофа, 2004.
  18. Шапиро Л.С. Микроорганизмы. Вирусы. Бактерии. Грибы. – М.: ЭЛБИ, 2003.
  19. Шлегель Г. Общая микробиология: пер. с нем.– М.: Мир, 1987.
  20. ГОСТ Р 51074-97. Продукты пищевые. Информация для потребителя. Общие требования.
  21. СанПиН 2.1.4.1074–01. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества.— 1.01.2002.
  22. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды. Методические указания. 4.2.1018–01.— 1.07.2001.
  23. Санитарно-паразитологические исследования воды хозяйственно-го и питьевого предназначения. 4.2.964–2000.
  24. ГОСТ 18963–73. Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа.
  25. ГОСТ 30425–97. Консервы. Метод определения промышленной стерильности.
  26. ГОСТ 9225–84. Молоко и молочные продукты. Методы микро-биологического анализа.
  27. ГОСТ 30347–97. Молоко и молочные продукты. Методы определения Staphilococcus aureus.
  28. ГОСТ 26809–86. Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу.
  29. МУК 4.2.1018-01. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды / Методические указания.— М.: МЗ РФ, 2001.
  30. МУ № 2.1.7.730–99. Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест / Методические указания.— М.: МЗ РФ, 1999.
  31. ГОСТ 17.4.2.01–81. Охрана природы. Почва. Номенклатура показателей санитарного состояния.