Интенсификация амилолитических энзимов в биотехнологии глубокой переработки зерна

№88-1,

технические науки

Биотехнологическую активность амилаз, катализирующих гидролитическое расщепление крахмальных макромолекул при глубокой переработки зерна, можно интенсифицировать и регулировать на супрамолекулярном уровне различными методами: подбором биотехнологичных энзимов и др. Третичная наноструктура амилолитических ферментов способствует усилению комплементарности энзима+крахмала перерабатываемого зерна.

Похожие материалы

Создание технологических производств глубокой переработки зернового сырья и вторичных фиторесурсов на основе инновационных процессов биокаталитической трансформации в конкурентоспособные продукты является перспективным для устойчивого функционирования экономики Российской Федерации. Реализация ресурсосберегающих биотехнологий позволяет увеличить рентабельность производства продуктов глубокой переработки зерна, обеспечить импортозамещение глюкозо-фруктозных сиропов, уменьшить конъюнктурное влияние на агропромышленный комплекс спроса и предложения на рынке зерна в РФ. [1]. Кроме того, в проекте «Долгосрочной стратегии развития зернового комплекса РФ до 2025 года и на перспективу до 2030 года» предполагается увеличить к 2030 году рост объема индустриальной переработки зернового сырья до 10,6 млн. тонн в год, из которых до 5 млн. тонн составит глубокая переработка зерна.

Цель данной работы — оригинальная интерпретация супрамолекулярного воздействия амилаз на крахмалсодержащие субстраты и влияние интенсифицирующих факторов на энзиматическую активность при гидролизе зернового сырья агрокультур.

Важнейшим сырьем для биотехнологической глубокой переработки зерна на современном этапе являются кукуруза и пшеница. Под воздействием разнообразных амилолитических ферментов полисахариды зернового крахмала (амилоза и амилопектин) расщепляются до олигосахаридов (декстрины), дисахаридов (мальтоза) и моносахаридов (глюкоза) [2]. Основная часть амилаз (лат. «amylum — крахмал») сухих семян и зернопродуктов находится в неактивном состоянии, а функциональная активность энзимов не проявляется вследствие отсутствия свободных молекул воды, необходимых для протекания биотехнологических реакций гидролиза полисахаридов.

Растительное зерно пшеницы и кукурузы в качестве субстрата отличается многокомпонентным составом, существенная масса биополимеров (крахмал ≈60-75%) нерастворимы в воде, нативное сырье включает ингибирующие компоненты. Обычно ферментные препараты используют для биоконверсии растительного сырья на первой, наиболее трудоемкой стадии его глубокой переработки для сохранения качества пищевых продуктов или улучшения органолептических характеристик.

Амилолитические энзимы (гликозид-гидролазы): α-амилаза [КФ 3.2.1.1], β-амилаза [КФ 3.2.1.2], глюкоамилаза [КФ 3.2.1.3] и др. используются в метаболической конверсии глубокой переработки растительного крахмалсодержащего сырья. Использование ферментных препаратов позволяет интенсифицировать биотехнологические процессы: максимальная активность амилаз при 90-95ºС значительно уменьшает себестоимость продукции за счет сокращения дозировки энзима и снижения длительности гидролиза крахмала и т.д.

В настоящее время ферментативный способ переработки крахмальных макромолекул, основанный на последовательном использовании a-амилазы бактерий Bacillus subtilis (амилосубтилин) и амилоглюкозидазы микрогрибов Aspergillus orizae (амилоризин) заменил кислотный гидролиз. Главное преимущество энзимного расщепления связано с регулируемой избирательностью, увеличением кинетики гидролитического процесса, получением олигосахаридных декстринов с высоким декстрозным эквивалентом (ДЭ). Величина ДЭ отражает глубину ферментативного гидролиза крахмала, для которого ДЭ считается равным нулю. Следующим инновационным шагом является внедрение в производство термостабильных a-амилаз, главным образом из Bacillus licheniformis, позволяющих довести величину ДЭ, близким к 100 [3].

В супрамолекулярном механизме регуляции каталитической активности различных амилазных энзимов на крахмальный субстрат при глубокой переработки зернового сырья имеются отличия: α-амилаза неселективно гидролизует крахмальные макромолекулы внутри полиглюкановой цепи и в результате образуются декстрины, мальтоза и α-глюкоза. β-Амилаза отщепляет с конца макромолекул амилозы и амилопектина дисахарид β-мальтозу, а фермент глюкоамилаза катализирует неспецифическое отщепление остатков глюкозы; амило-1,6-глюкозидаза действует на точки разветвления макромолекул амилопектина.

Реализация глубокой переработки зерна агрокультур ферментативным расщеплением макромолекул амилозы и амилопектина крахмального субстрата сопряжена тщательной подготовкой сырья: вида (особенностями агроландшафтных условий выращивания [4]) и состояния крахмала (нативный или клейстеризованный), выбором источника выделения амилазных препаратов, а также мониторингом формирования энзим+субстратных цитоструктур. Например, оптимальными условиями действия амилолитических ферментов на крахмальные макромолекулы являются: рН 5–8 (влияние среды на формирование энзим+субстратного комплекса), температура 50–75°С и присутствие ионов кальция, а также отсутствие ингибиторов: ионов железа, меди и др.

α-Амилаза (1,4-α-D-глюкан-глюканогидролаза) является кальций-зависимым ферментом: ионы Са2+ стабилизируют вторичную и третичную структуру макромолекулы энзима и одновременно предохраняют фермент от инактивирующего воздействия протеаз [5]. Активный центр α-амилаз — фермента, гидролизующего α-1,4-гликозидные связи в молекуле крахмала — представлен остатками гистидина, аспарагиновой кислоты и тирозина. Третичная наноструктура амилаз [6] формируется за счет самоорганизации доменов и это приводит к усилению комплементарного оптимума энзима+крахмального субстрата (рис. 1):

3-D модель третичной структуры α-амилазы глубокой переработки крахмальных макромолекул (1 — домен «связывания» энзима с гранулами крахмала; 2 — домен «щипцов» расщепляющих полисахариды)
Рисунок 1. 3-D модель третичной структуры α-амилазы глубокой переработки крахмальных макромолекул (1 — домен «связывания» энзима с гранулами крахмала; 2 — домен «щипцов» расщепляющих полисахариды)

Активные центры амилолитических энзимов сформированы радикалами аминокислотных остатков аспарагиновой (Asp) и глутаминовой (Glu) кислот, а также гистидина и тирозина. Например, в гидролизе макромолекул крахмала ферментом глюкоамилаза принимают участие карбоксильные группы Asp-55, Glu-179, Glu-400. Аминокислотные остатки аспарагиновой и глютаминовой кислот формируют активный центр изоэнзимов α-амилаз, а невариабельные домены аргинина, гистидина (за счет имидазольной группы) и тирозина по всей вероятности участвуют в позиционировании субстрата [7].

Регуляцию активности изоферментных α-амилаз можно осуществить за счет изменений рН среды и концентраций ионов кальция [8]. При рН 4,5 процесс инактивации α-амилаз в присутствии ионов кальция значительно замедляется стабилизирующим воздействием ионов кальция на супрамолекулярные цитонаноструктуры. Вероятно основной причиной кислотной регуляции активности следует считать вытеснение ионов Са2+ в энзиме водородными ионами и образование неустойчивой конфигурации из-за разрушения кальциевого мостика в третичной структуре амилаз.

Несмотря на доминирующую роль генетического фактора в биосинтезе микробиологических ферментов (экстенсивный метод регуляции активности), производительность биотехнологических процессов зависит и от состава питательной среды. При этом важно не только наличие субстратов и энзимов, но и биорегуляторов, играющих роль индукторов или репрессоров биосинтеза данного конкретного фермента. Одним из механизмов регуляции скорости расщепления крахмальных гранул является система протеиновых ингибиторов амилаз, широко представленных в растениях. Ингибиторы белковой природы избирательно взаимодействуют с амилазами и образуют неактивные комплексы "энзим + ингибитор".

В биотехнологических предприятиях глубокой переработки зерна эффективно используются разнообразные амилазы, активность которых зависит от температуры, рН среды, наличия ионов биогенных металлов (активаторов или ингибиторов) и т.п. Например, в работе [9] приведены уравнения последовательных реакций, происходящих при постепенной биодеградации крахмала под действием амилаз и кинетические характеристики, позволяющие рассчитать выход декстринов на разных стадиях биокатализа. Тонкая регуляция функционирования амилолитических ферментов на супрамолекулярном уровне позволяет использовать их успешно в индустрии продуктов функционального питания [10].

Следует отметить, что использование биотехнологических процессов энзиматического расщепления крахмала перспективны также в конструировании инновационных биодеградабельных полимеров [11]. На сегодняшний день технологически более разработано изготовление биодеградабельной упаковки, основанное на введении в синтетическую полимерную матрицу (полиэтилена и др.) компонентов (чаще всего крахмала), способствующих к «запуску» биохимических реакций деструкции. Более перспективным направлением является конструирование упаковочных материалов на основе макромолекул бактериальных полигликолидов и полилактидов, которые экономически выгодно получать биосинтетической технологией на базе продуктов энзиматического расщепления крахмального зерна.

Таким образом, активность амилолитических ферментов, катализирующих гидролиз макромолекул крахмал при глубокой переработки зерна, можно регулировать на супрамолекулярном уровне разнообразными методами. Использование микробиологических амилаз позволяет интенсифицировать биотехнологические процессы за счет снижения продолжительности гидролиза крахмалсодержащего сырья.

Список литературы

  1. Mamychev A.Yu., Ivanova O.V., Rachinskaya Yu.S., Kobersy I.S. Transformation of the modern agro-industrial complex of the North Caucasus under conditions of import substitution under the influence of western sanctions // International Journal of Applied Business and Economic Research. 2017. V.15. N.12. P.35-42.
  2. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. – М.: КолосС, 2004. – 296 с.
  3. Nigam Р.S. Microbial enzymes with special characteristics for biotechnological applications // Biomolecules. 2013. N.3. Р.597-611.
  4. Халиков Р.М., Латыпова З.Б. Агроландшафтные и биотехнологические особенности глубокой переработки зерновок кукурузы // Сб. материалов конф. “Modern trends in science and education”. – София: Издателска Къща «СОРоС», 2017. С.568-572.
  5. Гамаюрова В.С., Зиновьева М.Е., Васина К.Л. Активация и стабилизация ферментных препаратов неорганическими соединениями // Вестник Казанского технологического университета. 2009. №6. С.121-129.
  6. Халиков Р.М. Технологическая регуляция активности амилолитических энзимов на наноструктурном уровне комплементарности // Сб. тр. Международ. конф. «Совр. тенденции в науке и образовании». Ч.III. – М.: АР-Консалт, 2015. С.94-96.
  7. Bozonnet S., Bonsager B.C., Kramhoft B. et al. Binding of carbohydrates and protein inhibitors to the surface of α-amylases // Biologia (Bratislava). 2005. V.60 / Suppl.16. P.27-36.
  8. Van der Maarel M., van der Veen B., Uitdehaag J. et al. Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family // Journal of Biotechnology. 2002. V. 94. N. 2. P. 137-155.
  9. Ермолаева Г.А. Управление процессом биокатализа крахмала // Хранение и переработка сельхозсырья. 2017. № 4. С.22-24.
  10. Ананских В.В., Шлеина Л.Д., Ананских Л.А. Оптимизация параметров получения мальтодекстрина и кормового продукта из кукурузной муки // Достижения науки и техники АПК. 2017. Т. 31. № 11. С.91-93.
  11. Ivanova O.V., Khalikov R.M., Ivanov L.A. Biodegradable packaging polymers: construction, usage // Issues of science and education: theoretical and practical aspects. – Praha: Vydavatel «Osvícení», 2017. Р.112-115.