Анализ жизнеспособности красной смородины в условиях in vitro

№105-1,

биологические науки

Для сохранения биоразнообразия культурных растений и их диких предков создаются ботанические сады и различные генетические банки, где сорта и виды растений могут сохраняться в неизменном состоянии. На данном этапе развития науки одним из передовых методов сохранения генотипов растений является метод культивирования на искусственной питательной среде in vitro, и метод криоконсервации, однако эти методы нуждаются в оптимизации для каждого отдельного рода растений. Актуальность работы заключается в изучении жизнеспособности эксплантов красной смородины на различных питательных средах, а также анализе посткриогенной регенерации после криозаморозки методом витрификации с целью подбора оптимальных методик для данной культуры.

Похожие материалы

In vitro коллекции, в отличие от, семенных и криоколлекций, не отличаются миниатюрностью, однако позволяют поддерживать образцы в регулируемых условиях, изучать их строение и устойчивость к различным неблагоприятным условиям среды [1, 3]. Также in vitro коллекции используются для оздоровления образцов от вирусных и бактериальных инфекций. Недостатком таких коллекций является сравнительная дороговизна метода и необходимость частых пересадок, что в свою очередь может повлечь за собой сомаклональную изменчивость [2] образцов или контаминацию питательных сред нежелательными мкроорганизмами [3, 4].

Метод криоконсервации меристем отличается миниатюрностью, минимизацией риска контаминации и генетических изменений в образцах, гипотетически бессрочной возможностью хранения. Кроме того, этот метод требует меньше труда для поддержания коллекций. Отрицательной стороной метода считается то, что не все экспланты могут стабильно развиваться после заморозки до сверхнизких температур, а также его дороговизна [2].

Для оптимизации данных методов поддержания коллекций для красной смородины необходимо проанализировать жизнеспособность меристемных эксплантов различных сортов при введении в культуру тканей, а также после проведения криоконсервации и разморозки образцов.

Эксперимент включил в себя следующие этапы:

  • Получение эксплантов из верхушечных и пазушных почек черенков красной смородины;
  • Подбор оптимальной питательной среды;
  • Анализ жизнеспособности эксплантов в процессе культивирования in vitro;
  • Проведение криозаморозки образцов с последующим их оттаиванием;
  • Анализ жизнеспособности размороженных эксплантов.

Материалом исследований явились образцы красной смородины сортов Натали, Вика, Серёжка, Нива и Татьяна. Питательной средой для эксплантов была выбрана безгормональная среда Мурасиге-Скуга (МС) для первых двух недель и ½ МС для 3-й и 4-й недели [5].

Измерение среднего прироста (мм) для каждого сорта начали спустя 2-3 недели после введения каждого сорта в культуру (так как статистически важно анализировать уже прижившиеся и приблизительно уравненные экспланты), и проводили на протяжении 4-х недель, пока рост эксплантов не вышел на плато, отобразив полученные результаты в графике (рис. 1):

Динамика увеличения средней высоты микрорастений в течение культивирования на питательных средах: МС и 1/2 МС
Рисунок 1. Динамика увеличения средней высоты микрорастений в течение культивирования на питательных средах: МС и 1/2 МС

На основании данных, представленных на графике,можно сделать вывод, что самый активный рост и жизнеспособность эксплантов были характерны для сорта Натали, наиболее слабыепоказатели выявлены у сорта Серёжка.

Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что наилучшей жизнеспособностью обладали экспланты сортов Натали и Татьяна, так как они сохраняли способность к значительному приросту еще на протяжении недели после пересадки их на менее концентрированную среду.

Наиболее чувствительными к изменению концентрации питательных веществ в среде оказались сорта Нива и Вика, поскольку у эксплантов этих сортов резко снизился уровень среднего прироста после пересадки их на менее концентрированную среду.

Показанная сортом Серёжка наибольшая стабильность может сигнализировать о высокой степени устойчивости к неблагоприятным факторам среды.

Таким образом, для поддержания коллекции in vitro было выявлено преимущество питательной среды МС перед ½ МС. Кроме того, с помощью методики культивирования in vitro нами были выявлены такие характеристики сортов, как жизнеспособность, скорость роста, устойчивость к факторам среды, при том, исследования этих характеристик на культуре in vitro заняли в несколько раз меньше времени, чем исследование в естественных полевых условиях [6].

С целью изучения возможности длительного сохранения меристем красной смородины экспланты изучаемых сортов после предварительной подготовки замораживались в жидком азоте (-196°C) методом ускоренной витрификации.

Подготовительный этап. С поддерживаемых ранее в культуре in vitro растений изолировали верхушечные и пазушные почки [7], помещали их на 1 час в жидкую питательную среду МС, чтобы предотвратить высыхание. После отстаивания эксплантов в среде проводили их обработку криопротекторами. Для этого помещали почки в чашки Петри, наполненные предварительно стерилизованной средой LS (Loading Solution), инкубруя их в течение 20 минут при температуре 20°C на свету, после чего переносили экспланты в криопробирки, наполненные заранее простерилизованным раствором PVS2 (Plant Vitrification Solution) на 30 мнут при температуре 0°C (на льду).

Криоконсервация. Криопробирки помещались в вакуумный аппарат УБЗ-1 (ультрабыстрый замораживатель), наполненный жидким азотом, на 10 минут. В вакууме скорость падения температуры доходит до 1000°C в минуту, что позволяет эффективнее «проскочить» фазу образования кристаллов воды, сразу переводя ее в аморфный, витрифицированный лед. После проведения заморозки, при соблюдении требований техники безопасности, криопробирки быстро извлекались из аппарата и помещались на хранение в криотанк, наполненный жидким азотом [8].

После проведения размораживания экспланты красной смородины инкубировались в жидкой питательной среде RS в течении 20 мин, а затем были пересажены на твердую питательную среду МС, а также на питательную среду с гормонами роста для почек и меристем МС+БАП. 10-дневное проращивание на этой питательной среде на свету показало, что экспланты потеряли жизнеспособность (рис. 2).

Экспланты, потерявшие жизнеспособность после криозаморозки
Рисунок 2. Экспланты, потерявшие жизнеспособность после криозаморозки

Из этого можно сделать вывод, что примененный алгоритм криоконсервации меристем красной смородины не подходит для данной культуры. Необходимо продолжать исследования, чтобы провести корректировку стадий заморозки и состава питательных сред с целью определения оптимального алгоритма криосохранения.

Список литературы

  1. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС. -1999.- с. 54-101.
  2. Кунах В.А. Генетическая изменчивость соматических клеток растений. Каллусообразование in vitro // Биополимеры и клетка. -1997.-№4.- с. 298-319.
  3. Дунаева С. Е., Пендинен Г. И., Антонова О. Ю., Швачко Н. А.,Ухатова Ю.В., Шувалова Л. Е., Волкова Н. Н., Гавриленко Т. А. Сохранение вегетативно размножаемых культур в in vitro и криоколлекциях. Методические указания. 2-е издание, расширенное и дополненное // Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н. И. Вавилова (ВИР).СПб.: ВИР. -2017.- с. 11-36.
  4. Дзюбенко Н. И., Потокина Е. К. Деятельность генных банков в целях мониторинга и предотвращения наиболее опасных последствий генетической эрозии // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. СПб.: ВИР. -2009.- Т.166. с. 381–388.
  5. Gamborg O. L., Eveleigh D. E. Culture methods and detection of glucanasesin suspension culture of wheat and barley // Canadian Journal of Biochemestry. -1968.-Vol. 46.- No. 5.- p. 417-421.
  6. Engelmann F. Use of biotechnologies for the conservation of plant biodiversity // In Vitro Cellular and Developmental Biology — Plant. -2011. -№47. — p. 5-16.
  7. Wang, B. Potential applications of cryogenic technologies to plant genetic improvement and pathogen eradication // Biotechnology Advances. -2014- №32 — p. 583.
  8. Ситников М.Н., Вержук В.Г., Павлов А.В., Бондарук Д.Д. Анализ жизнеспособности пыльцы абрикоса и черешни после криоконсервации. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. СПб. 2018, Т.179 №3 C. 152-158.