Введение
Горизонтальным переносом генов называют получение генетического материала не от непосредственного предка, а от организма другой эволюционной линии. У бактерий такой обмен является распространённым механизмом приобретения новых свойств, включая устойчивость к антибиотикам. У многоклеточных животных подтверждённые случаи горизонтального переноса встречаются значительно реже и требуют особенно строгой проверки.
Сложность состоит в том, что сходство последовательности животного с бактериальным геном допускает по меньшей мере две интерпретации. Ген мог действительно попасть в геном хозяина и закрепиться в нём, но бактериальная последовательность также могла оказаться в данных вместе с ДНК симбионта, пищи или поверхностного микроорганизма. При секвенировании небольших животных риск такого смешения особенно высок.
Показательным примером стала история изучения генома тихоходки, которая в публикациях 2015–2017 годов называлась Hypsibius dujardini. В 2018 году было установлено, что распространённая лабораторная линия Z151 относится к отдельному виду — Hypsibius exemplaris. Следовательно, результаты рассматриваемых работ относятся прежде всего к конкретной модельной культуре, а не ко всему типу Tardigrada [7].
Цель настоящей работы — проследить, как обнаружение контаминации изменило оценку горизонтального переноса генов у тихоходок, а также определить признаки, позволяющие отличить перенесённый ген от посторонней последовательности в геномной сборке.
Материалы и методы
Проведён сравнительный анализ работ, представляющих основные этапы научной дискуссии:
- первоначальное секвенирование генома и оценка доли чужеродных генов;
- независимое секвенирование той же модельной культуры;
- метагеномный поиск загрязняющих последовательностей;
- секвенирование ДНК одной очищенной особи;
- сравнительная пересборка геномов двух видов тихоходок.
Сопоставлялись размер сборки, способы подготовки образцов, число предполагаемых горизонтально перенесённых генов и критерии их верификации. Поскольку в исследованиях применялись разные алгоритмы аннотации и пороговые значения, приведённые оценки следует рассматривать в контексте методологии каждой работы, а не как непосредственно взаимозаменяемые показатели.
Первоначальная гипотеза о 17,5% чужеродных генов
В 2015 году Т. Бутби и соавторы опубликовали черновую сборку генома H. dujardini размером 212,3 млн пар оснований. По их оценке, примерно одна шестая часть аннотированных генов — около 17,5% — была получена посредством горизонтального переноса. Предполагаемыми донорами назывались бактерии, растения, грибы и археи [1].
Вывод основывался не только на результатах поиска сходных последовательностей. Авторы использовали филогенетический анализ и проверяли физическую связь части предполагаемых чужеродных фрагментов с последовательностями тихоходки. Была выдвинута гипотеза, согласно которой повреждение ДНК при высыхании и последующее восстановление генома после регидратации могли облегчать включение внешнего генетического материала.
При подтверждении такой оценки тихоходка стала бы животным с беспрецедентно высокой долей горизонтально приобретённых генов. Возникло также предположение, что заимствованные гены могли расширить набор механизмов, участвующих в переносимости экстремальных условий. Однако необычный результат одновременно требовал исключить более простое объяснение — присутствие в сборке ДНК других организмов.
Почему образцы тихоходок подвержены контаминации
Тихоходки имеют микроскопические размеры, а количество ДНК, получаемое от одной особи, крайне мало. Ранние протоколы поэтому предполагали объединение большого числа животных. Вместе с ними в образец могли попасть:
- бактерии с поверхности тела;
- микроорганизмы из пищеварительного тракта;
- водоросли, использовавшиеся как корм;
- другие организмы неаксеничной лабораторной культуры;
- свободная ДНК, находившаяся в питательной среде.
Алгоритм сборки не определяет автоматически, какому организму принадлежит каждый прочитанный фрагмент. Если данные не очищены заранее, бактериальные риды могут образовать самостоятельные контиги и скаффолды. После автоматической аннотации гены на таких фрагментах ожидаемо оказываются похожими на бактериальные. В этом случае высокий показатель «чужеродности» отражает не историю генома животного, а состав исходного образца.
Особенно подозрительным был размер первоначальной сборки. Независимые измерения указывали, что гаплоидный геном модельной тихоходки должен иметь размер около 100 Мб, тогда как сборка 2015 года превышала 212 Мб. Само по себе расхождение не доказывало загрязнение, но указывало на необходимость проверки состава последовательностей.
Независимая сборка и обнаружение посторонней ДНК
В 2016 году Г. Кутсовулос и соавторы независимо секвенировали геном той же лабораторной культуры. Авторы изначально рассматривали материал как смесь ДНК нескольких организмов и применили метагеномные методы фильтрации. При классификации контигов учитывались таксономическое сходство, глубина покрытия, нуклеотидный состав и согласованность прочтений.
После удаления наиболее очевидных контаминантов была получена сборка размером около 135 Мб. Среди 23 021 предсказанного гена сильными кандидатами на перенос от бактерий оказались приблизительно 0,2%, ещё около 0,2% могли происходить от не относящихся к животным эукариот. С учётом менее определённых случаев верхняя оценка была установлена на уровне 1–2% [2].
Сравнение с первой сборкой показало, что большинство последовательностей, ранее интерпретированных как результат горизонтального переноса, соответствовало контаминантам. Дополнительные анализы обнаружили среди спорных фрагментов последовательности, сходные с крупными частями бактериальных геномов. Распределение покрытия и таксономических признаков также лучше согласовывалось с присутствием нескольких организмов, чем с тысячами независимо встроившихся генов [3], [4].
Секвенирование одной особи как экспериментальный контроль
Биоинформатическая фильтрация уменьшает контаминацию, но зависит от выбранных порогов и полноты баз данных. Другой подход состоит в изменении самого способа подготовки материала.
К. Аракава и соавторы разработали протокол секвенирования одной особи H. dujardini. Перед выделением ДНК животное выдерживали без пищи, обрабатывали антибиотиками и многократно промывали. Это не гарантировало абсолютной стерильности, но значительно уменьшало количество посторонней ДНК ещё до секвенирования [5].
Прочтения, полученные от одной особи, хорошо картировались на очищенную независимую сборку. В первоначальной сборке 2015 года, напротив, были выявлены 5665 контигов общей длиной 56,8 Мб, почти не покрывавшихся новыми прочтениями. Они составляли около 22% её длины. Этот результат стал независимым экспериментальным свидетельством того, что в опубликованную сборку попало значительное количество последовательностей, не принадлежащих геному тихоходки.
При этом сборка из одной особи размером около 132,5 Мб была фрагментированной и создавалась как технический контроль, а не как окончательный референсный геном. Её значение состояло прежде всего в возможности проверить происхождение спорных контигов.
Как менялись оценки горизонтального переноса
| Исследование | Подход | Размер сборки | Интерпретация HGT |
|---|---|---|---|
| Boothby et al., 2015 | Массовый образец, черновая сборка | 212,3 Мб | Около 17,5% аннотированных генов |
| Koutsovoulos et al., 2016 | Независимое секвенирование и метагеномная фильтрация | 135 Мб | Около 0,4% сильных кандидатов; не более 1–2% с учётом неопределённых случаев |
| Arakawa et al., 2016 | Секвенирование одной очищенной особи | 132,5 Мб, техническая сборка | Доля HGT не рассчитывалась; подтверждено значительное загрязнение первой сборки |
| Yoshida et al., 2017 | Очищенная сравнительная сборка, короткие и длинные прочтения | 104 Мб | 0,7% высокодостоверных кандидатов; 2,3% как верхняя граница |
Сокращение сборки с 212,3 до 104 Мб объяснялось не только удалением микробных контигов. Дополнительным источником завышения была неслитая гетерозиготность. Если две версии одного участка, унаследованные от разных родителей, достаточно различаются, алгоритм может собрать их как отдельные фрагменты. Такие гаплотиги ошибочно увеличивают размер сборки и число предсказанных генов, хотя не являются ни новыми генами, ни контаминантами.
Как отличить горизонтальный перенос от загрязнения
Надёжное подтверждение горизонтального переноса требует согласования нескольких независимых признаков.
- Филогенетическое положение. Предполагаемый ген должен устойчиво группироваться с генами вероятного донора, а не с последовательностями животных. Простого выбора лучшего результата BLAST недостаточно: близкие гомологи животного могут отсутствовать в базе или быть слишком быстро эволюционировавшими.
- Физическая связь с геномом хозяина. Кандидат должен находиться на достаточно длинном фрагменте рядом с подтверждёнными генами животного. Парные и длинные прочтения должны непрерывно перекрывать границы между предполагаемым чужеродным геном и окружающей последовательностью.
- Согласованное покрытие. Глубина покрытия кандидата должна соответствовать остальному геному. Резко отличающиеся значения могут указывать на микроорганизм с другой численностью клеток или числом копий генома.
- Воспроизводимость. Последовательность необходимо обнаружить у независимо очищенных особей, в другой библиотеке или в отдельной лабораторной линии. Отсутствие кандидата во всех независимых данных усиливает гипотезу контаминации.
- Структура и экспрессия гена. Наличие интронов и транскриптов может поддерживать гипотезу интеграции, но не доказывает её. Интроны иногда появляются как результат автоматического предсказания генов, а РНК микроорганизмов также может присутствовать в транскриптомной библиотеке.
- Сохранение в родственных видах. Если ген присутствует в гомологичном геномном окружении у нескольких тихоходок, вероятность его устойчивой интеграции возрастает. Однако этот критерий хуже применим к недавним переносам, произошедшим после разделения видов.
Таким образом, ни бактериальное сходство, ни экспрессия, ни один удачно амплифицированный участок по отдельности не позволяют провести границу между HGT и загрязнением.
Что осталось после очистки генома
В 2017 году И. Ёсида и соавторы представили улучшенную сборку генома длиной 104 Мб и провели сравнительный анализ H. dujardini и Ramazzottius varieornatus. На первом этапе по индексу горизонтального переноса было отобрано 463 гена. После филогенетической проверки, анализа экспрессии и поиска гомологов у второго вида высокодостоверный набор сократился до 133 генов, или приблизительно 0,7% аннотированного генома. Число 463, соответствующее 2,3%, было сохранено только как верхняя граница [6].
Следовательно, пересмотр не привёл к выводу о полном отсутствии горизонтального переноса. Он показал, что тихоходки не обладают подтверждённой долей HGT порядка 17,5%. У двух изученных видов показатели оказались сопоставимы с оценками для других животных.
Некоторые сохранившиеся кандидаты могут иметь биологическое значение. Например, гены каталазы H. dujardini были отнесены к вероятным приобретениям бактериального происхождения, а часть кандидатов изменяла активность при переходе к ангидробиозу. Однако корреляция экспрессии с высыханием ещё не доказывает, что конкретный перенос сформировал экстремальную устойчивость. Для такого вывода необходимы функциональные эксперименты с подавлением или удалением соответствующего гена.
Методологическое значение дискуссии
История генома тихоходки показывает, что автоматическая сборка и аннотация не являются нейтральными этапами между секвенированием и биологическим выводом. Ошибка в определении происхождения контигов способна изменить не только количество генов, но и эволюционную интерпретацию организма.
Контаминация особенно опасна тогда, когда исследователь ищет горизонтальный перенос. В обоих случаях обнаруживается последовательность, наиболее похожая на ген другого таксона. Различие заключается в её физическом статусе: перенесённый ген является частью хромосомы хозяина, а контаминант принадлежит отдельному организму. Поэтому сначала необходимо доказать принадлежность последовательности геному, а уже затем объяснять её эволюционное происхождение.
Случай тихоходок также демонстрирует значение открытых исходных данных и независимой репликации. Публикация ридов и сборок позволила другим группам повторно классифицировать контиги, сопоставить независимые библиотеки и проверить первоначальную гипотезу экспериментально.
Ограничения интерпретации
Рассмотренные исследования не позволяют оценить распространённость горизонтального переноса у всех тихоходок. Основная дискуссия относилась к одной лабораторной линии, а сравнительная работа включала два вида.
Количество кандидатов зависит от качества сборки, состава референсных баз, метода аннотации и порогов филогенетического анализа. По мере появления геномов близких видов некоторые предполагаемые HGT-гены могут получить обычных животных гомологов, а другие, напротив, будут подтверждены как древние приобретения.
Особенно трудно распознавать древний перенос. За длительное эволюционное время чужеродный ген приобретает нуклеотидный состав, интроны и регуляторные особенности хозяина. Одновременно исходная последовательность может исчезнуть у предполагаемого донора или остаться неизвестной из-за недостаточной изученности соответствующей группы.
Заключение
Первоначальная оценка, согласно которой около 17,5% генов модельной тихоходки были получены посредством горизонтального переноса, не подтвердилась после независимого секвенирования и очистки данных. Значительную часть предполагаемых чужеродных генов удалось связать с микроорганизмами неаксеничной культуры, а завышенный размер сборок дополнительно объяснялся неслитой гетерозиготностью.
Улучшенная сборка сохранила небольшой набор вероятных горизонтально перенесённых генов: 0,7% были отнесены к высокодостоверным кандидатам, а 2,3% составили верхнюю оценку. Поэтому научный вывод состоит не в отсутствии HGT у тихоходок, а в отсутствии доказательств его исключительного масштаба.
Главный методологический результат дискуссии заключается в том, что таксономическое сходство последовательности должно рассматриваться только как начало проверки. Для подтверждения горизонтального переноса необходимы филогенетический анализ, физическая связь с геномом хозяина, согласованное покрытие, независимые образцы и функциональная верификация.