Изучение полиморфизма гена CHIT1 в популяционной выборке Кабардино-Балкарии

№117-1,

биологические науки

Впервые получены статистические оценки частот аллелей и генотипов по полиморфизму гена CHIT1 у разных возрастных групп, проживающих в Кабардино-Балкарии. Выявлены различия по частотам аллелей и генотипов у лиц контрольной группы и группы долгожителей. Анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфизму гена CHIT1 в контрольной группе и группе долгожителей показал, что с наибольшей частотой встречаются генотипы ТТ и ТН, а также аллель Т, и снижена доля носительства генотипа НН. При попарном сравнении мужчин и женщин двух возрастных групп статистически достоверных различий по частотам аллелей и генотипов не выявлено.

Похожие материалы

Введение

Изучение механизмов старения, а также факторы и заболевания, которые непосредственно влияют на продолжительность жизни, становится все более актуальной темой, и все больше возрастает интерес к разработке важных вопросов, связанных с продлением здоровой жизни.

За последние годы большое число исследований были направлены на выявление генетических полиморфизмов, которые благоприятствуют долголетию. На продолжительность жизни могут влиять целый комплекс факторов — это экзогенные, эндогенные, а также генетические и эпигенетические факторы. Среди них особый интерес при изучении продолжительности жизни имеют эффективность иммунной и репарационной систем, изменение состояния сердечно-сосудистой системы и признаки, которые влияют на темп созревания и старения организма [1].

Так как одним из важнейших видов изучения продолжительности жизни является анализ иммунного потенциала организма, актуальным считается изучение изучение функционирования иммунной системы [2]. Хитотриозидаза человека (CHIT1) является хитинолитическим ферментом , участвующий в основном в иммунной и воспалительной реакции, который является признанным маркером активации макрофагов [3].

Хитотризидаза человека высоко выражен при различных заболеваниях и сопровождается воспалительным процессом [4] , например при болезни Гоше, саркоидозе , астме, инфекционных заболеваниях, болезни Альцгеймера, эндометриозе, а также у курильщиков [5].

Предполагают, что CHIT1 играет защитную роль в организме человека, участвуя тем самым в борьбе с хитинсодержащими патогенами, или как элемент в каскаде иммунных реакций [6]. Также не исключается возможность прямого участия хитотриозидазы в патогенезе болезней [7].
Аллельный полиморфизм гена CHIT1 обнаруживает этнографическую закономерность [8]. В свою очередь, среди генетических факторов, влияющие на продолжительность жизни, большое значение имеет сочетание определенных полиморфизмов в различных генах, а также взаимосвязи «ген-ген» и «ген-среда» [9]. В связи с этим весьма актуальным стало изучение характера распределения полиморфизма гена CHIT1 в популяционных выборках КБР, представленных старческой группой и долгожителями.

Существует распространенный полиморфизм в гене хитотриозидазы (CHIT1), при котором дубликация 24 п.н. в экзоне 10 приводит к аберрантному сращиванию и удалению 87 нуклеотидов [10].

Фермент хитотриозидаза был лучшим исследуемым геном человека относительно его биологической активности и связи с различными нарушениями [11]. В здоровой популяции активность CHIT1 очень низка и возникает в циркулирующих полиморфоядерных клетках. И, наоборот, ферментативная активность CHIT1 значительно возрастает при развитии острых/хронических воспалительных расстройств[12].

Материалы и методы

В качестве материала исследования использовались биологические образцы, собранные у коренных жителей Кабардино-Балкарской Республики. В процессе работы были сформированы две выборки: выборка долгожителей составила 31 человека от 90 до 104 лет, средний возраст выборки составил 92,55±0,679 года. Общая выборка контрольной группы состояла из 28 человек (средний возраст 18,86±0,275 года).

Сбор биологического материала проводился в ходе экспедиционных выездов в населенные пункты Кабардино-Балкарской Республики, таких как Нальчик, Прохладный, Кашхатау, Залукокоаже, Сармаково, Каменномост, Кенже, Малка, Куркужин, Карагач, Урвань, Псынадаха, Верхний Акбаш, Тырныауз, Жемтала, Яникой, Каменка, а также в Республиканском Геронтологическом Центре.

Биологические образцы и данные были собраны с получением информированного согласия обследуемых или их законных представителей. Участники проекта были полностью информированы обо всех аспектах своего участия в исследовании. Забор венозной крови проводился сертифицированной медицинской сестрой после предварительного анкетирования с участниками эксперимента или их представителями.

Анкетирование предусматривало регистрацию пола, возраста, этнической принадлежности, состояния здоровья, а также наличия в роду долгожителей.

Забор буккального соскоба проводился самостоятельно стерильным зондом с перенесением образцов в индивидуальные стерильные пробирки.

Для проведения молекулярного генетического анализа образцов нами были использованы различные коммерческие системы выделения ДНК «QIAmpDNAbloodMiniKit» (производитель «Qiagen», Германия), набор выделения ДНК из буккального соскоба («Литех», Москва), коммерческий набор для постановки ПЦР — анализа Screenmix (OOO«Евроген», Москва), олигопраймеры («Бигль», Санкт-Петербург), буферные растворы для электрофореза, агарозы, маркеры молекулярного веса М50, лабораторный пластик.

Для амплификации полиморфизма T/H гена CHIT1 использовались праймеры, фланкирующие полиморфный участок в 10-м экзоне (Rigatetal., 1990). Для электрофореза набирали в пипетку 5-8 мкл амплификата и наносили на заранее приготовленный 3% агарозный гель.

Проводили электрофоретическую детекцию с регистрацией результатов дискретных полос.

Носительство аллеля Т определялось по наличию флюоресцирующего в ультрафиолетовом свете фрагмента в зоне 75 п.н., аллеля Н — в зоне 99 п.н.

Результаты и обсуждения

В процессе исследования нами были сформированы две выборки — контрольная группа и группа долгожителей. Общая выборка составила 59 человек. Из них 31 человек — долгожители, средний возраст которых составляет 92,55±0,679 года , 28 человек — контрольная группа, средний возраст 18,86±0,275 года. При генотипировании локуса CHIT1 в исследуемых образцах ДНК нами были выявлены все три возможных генотипа данного гена — это ТН, ТТ, НН.

При анализе анкетных данных, которые были предоставлены самими обследуемыми, было показано, что в контрольной группе половина заявила о наличии в роду долгожителей. В группе долгожителей 20 человек из 31 имели долгожителей среди родителей или бабушек и дедушек (таблица 1).

Таблица 1. Распределение обследованных по возрасту и наличию в их роду долгожителей

Возраст

обследованных

Есть

долгожители

Всего (число

индивидов)

Долгожители

в роду женщин

Долгожители

в роду мужчин

Всего

Контроль

17-24 года

14 (50%)

28

6 (0,4%)

8 (0,5%)

14

Долгожители

90-104 года

20 (64%)

31

9(0,45%)

11(0,55%)

20

Внутри группы контроля проведено сопоставление между индивидами, указавшими на наличие в роду долгожителей, и индивидами, у которых долгожители в роду не отмечены. Распределения частот генотипов гена CHIT1 в двух группах статистически значимых различий не имеют (таблица 2, 3).

Таблица 2. Сопоставление частот встречаемости генотипов и аллелей гена CHIT 1 в контрольной группе соответственно присутствию в роду долгожителей

Генотипы

Мужчины

(N=8 чел.)

Женщины

(N=6 чел.)

Общая выборка (N=14)

ТН

2(0,25)

1(0,16)

3(0,21)

ТТ

5(0,62)

4(0,66)

9(0,64)

НН

1(0,12)

1(0,16)

2(0,14)

χ2

χ2= 0,162, df= 2, Р=0,922

Т

12 (0,75)

9 (0,75)

21(1,5)

Н

4 (0,25)

3(0,25)

7(0,5)

χ2

χ2=0,194, df=1, Р=0,659

Таблица 3. Сопоставление частот встречаемости генотипов и аллелей гена CHIT 1 в группе долгожителей соответственно присутствию в роду долгожителей

Генотипы

Мужчины N=11

Женщины N=9

Общая выборка (N=20)

ТН

3(0,27)

6(0,66)

9(0,45)

ТТ

8(0,72)

3(0,33)

11(0,55)

НН

-

-

-

χ2

χ2= 1,716, df=1, Р=0,190

Т

19 (0,86)

12 (0,66)

31(1,55)

Н

3 (0,16)

6 (0,34)

9(0,45)

χ2

χ2=1,218, df=1, Р=0,270

Проведенный нами анализ показывает, что внутри контрольной группы и группы долгожителей преобладающим является генотип ТТ. В контрольной группе генотип ТТ у мужчин составляет 662% , а у женщин 666%. В группе долгожителей генотип ТТ у мужчин наблюдается в количестве 72%, у женщин 333%. Доля генотипа НН в контрольной группе у мужчин составляет 112% и 116% у женщин. В группе долгожителей генотип НН отсутствует. Доля генотипа ТН выше в группе долгожителей (45%), чем в контрольной группе((21%).

Было выявлено, что доля аллеля ТТу мужчин долгожителей выше (86%) , чем у мужчин контрольной группы (75%), в то время как у женщин контрольной группы доля аллеля Т выше (75%) , чем у женщин-долгожителей (66%). Статистически достоверной разницы по частотам аллелей и генотипов в контрольной группе (χ2= 0,162, df= 2, Р=0,922) и группе долгожителей (χ2= 1,716, df=1, Р=0,190) между мужчинами и женщинами выявлено не было. Вероятно, с увеличением выборки выявленные различия частот аллей будут статистически достоверными.

Сравнительный анализ распределения частот генотипов в контрольной группе и группе долгожителей показал, что с наибольшей частотой выявлен генотип ТТ (67% и 54%, соответсвенно), а с наименьшей частотой был генотипирован НН-генотип (7% и 3%, соответственно) (таблица 4).

Таблица 4. Сравнение распределений частот встречаемости генотипов и аллелей гена CHIT1 в изученных группах

Выборка

Генотипы (число и частота)

Частоты аллелей

HH

TH

TT

Н

Т

Контроль

2 (0,07)

7 (0,25)

19 (0,67)

11 (0,19)

45 (0, 80)

Долгожители

1 (0,03)

13 (0,41)

17 (0,54)

15 (0,24)

47 (0,75)

χ2

χ2= 2,097, при df=2, p=0,350

χ2=0,319, df = 1, р=0,709

В выборке, представляющей группу долгожителей, распределение генотипов также достоверно не отличалось от равновесного по Харди-Вайнбергу, однако в этой группе доля гетерозигот оказалась значительно выше по сравнению с установленной для популяционного контроля (частота ТН-генотипа равна441% и225%, соответственно). Но различия между группами по частотам генотипов ТТ и ТН были не достоверными (χ2 = 2,097, при df = 2, р= 0,350). по

Проведенный анализ частот аллелей в двух возрастных группах показал, что с аллель ТТ является преобладающим в обоих группах (80% и 75%). а

Доля аллеля ННв группе долгожителей несколько выше (24%), чем в контрольной группе (19%), но различия не достигают уровня статистической значимости (χ2=0,319, df = 1, р=0,709). а

Гендерное распределение частот генотипов и аллелей в двух возрастных группах

Следующий этап наших исследований мы начали с анализа частот аллелей и генотипов в двух выборках по гендерному признаку.

Контрольная группа и группа долгожителей была разделена по половой принадлежности:

  • долгожители: мужчины –116 человек (средний возраст 92,19±1,005года), женщины — 15 человек (средний возраст 92,93±0,933года);
  • контрольная группа: мужчины –114 человек (средний возраст 19,5±0,465лет), женщины –114 человек (средний возраст 18,21±0,186лет).

Распределение частот аллелей и генотипов представлено в таблице 5 и 6.

Таблица 5. Гендерное распределение частот аллелей и генотипов в группе долгожителей

Генотипы

Женщины (N=15 чел.)

Мужчины (N=16 чел.)

ТТ

6 (0,4)

11 (0,68)

ТН

8 (0,5)

5 (0,3)

НН

1 (0,06)

-

χ2

χ2=3,134, df=2, Р=0,209

Т

20 (0,67)

27 (0,84)

Н

10 (0,33)

5 (0,16)

χ2

χ2=1,770, df=1, р=0,183

Проведенный нами анализ показал, что внутри группы долгожителей наблюдается увеличение частоты генотипа ТН у женщин (50%). Среди мужчины выявлено преобладание генотипа ТТ (68%) и не встречался генотип НН.

Аллель Т по частоте преобладало как у мужчин (84%), так и у женщин (67%). Было отмечено увеличение частоты аллеля Н у женщин (33%) в отличие от мужчин (16%). На данном этапе исследований полученные гендерные различия по частотам аллелей и генотипов в группе долгожителей не были статистически достоверными, но было замечено повышение гомозиготного генотипа ТТ у мужчин-долгожителей (68%) и гетерозиготного генотипа ТН у женщин (50%). Возможно, данная тенденция будет усиливаться с увеличением выборки.

Проведенный гендерный анализ по частоте аллелей и генотипов в контрольной группе показал, что преобладающим и в группе мужчин, и женщин является генотип ТТ (71% и 64%, соответственно). Статистически достоверной разницы по частотам аллелей и генотипов в контрольной группе между мужчинами и женщинами выявлено не было (χ2=0,195, df=2, Р=0,907).

Таблица 6. Гендерное распределение частот аллелей и генотипов в контрольной группе

Генотипы

Женщины (N=14)

Мужчины (N=14)

ТТ

10 (0,71)

9 (0,64)

ТН

3 (0,21)

4 (0,28)

НН

1 (0,07)

1 (0,07)

χ2

χ2=0,195, df=2, Р=0,907

Т

23 (0,82)

22 (0,79)

Н

5 (0,18)

6 (0,21)

χ2

χ2=0, 000 df=1, р=1,0

При попарном сравнении мужчин и женщин двух возрастных групп статистически достоверных различий по частотам аллелей и генотипов выявлено не было.

Таким образом, носители аллеля Т, которые способны вырабатывать высокоактивную хитотриозидазу, могут получить селективное преимущество перед носителями аллеля Н. На это прямо может указывать низкая частота его как в общей выборке индивидов с генотипом НН в группах долгожителей, так и контрольной группы. Хотя статистически достоверной разницы по частоте между двумя группами выявлено не было, возможно, при увеличении выборки картина может измениться. Поэтому можно предпололжить, что в условиях достаточности функции иммунной системы оптимальным является генотип ТН, однако при ослабленном иммунитете и сниженной способности противостоять патогенам, а также при высокой патогенной нагрузке преимущество могут получить именно носители генотипа ТТ, так как у них наблюдается способность к быстрому увеличению синтеза хитотриозидазы при патологическом процессе. по

Полученные нами данные говорят о том, что генотипы ТТ и ТН благоприятствуют долголетию, а у людей с генотипами НН шансы к долголетию малы. В этом отношении сниженная, но не отсутствующая активность хитотриозидазы, обусловленная генотипом ТН, может оказаться ближе к оптимуму реакции.

Список литературы

  1. Хрисанфова Е.Н., Перевозчиков И.В. Антропология. — М.: Наука, 2005. — 400 c.
  2. Eijk M., van Roomen C.P., Renkema G.H. et.аl. Characterization of human phagocyte-derived chitotriosidase, a component of innate immunity // Int. Immunol. — 2005. — Vol. 17, № 11. — P. 1505-1512.
  3. Kzhyshkowska J., Gratchev A., Goerdt S. Human chitinases and chitinase-like proteins as indicators for inflammation and cancer // Biomark.Insights. — 2007. — Vol. 2. — P. 128-146.
  4. Renkema G.H., Boot R.G., Muijsers A.O. et.al. Purification and characterization of human chitotriosidase, a novel member of the chitinase family of proteins // J. Biol. Chem. — 1995. — Vol. 270, № 5. — P. 2198-2202.
  5. Barone R., Simpore J., Malaguarnera L., Pignatelli S., Musumeci S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria // Clin. Chim. Acta. — 2003. — Vol. 331, № 1-2. — P. 79-85.
  6. Malaguarnera L. Chitotriosidase: the yin and yang // Cell Mol. Life Sci. — 2006. — Vol. 63, № 24. — P. 3018-3029.
  7. Malaguarnera L., Musumeci M., Di Rosa M., Scuto A., Musumeci S. Interferon-gamma, tumor necrosis factor-alpha, and lipopolysaccharide promote chitotriosidase gene expression in human macrophages // J. Clin. Lab. Anal. — 2005. — Vol. 19, № 3. — P. 128-132.
  8. Arndt S., Hobbs A., Sinclaire I., Lane A.B. Chitotriosidase deficiency: a mutation update in an african population // JIMD reports. — 2013. — Vol. 10. — P. 11-16.
  9. Gianfrancesco F., Musumeci S. The evolutionary conservation of the human chitotriosidase gene in rodents and primates // Cytogenet Genome Res.-2004.- Vol.105.- №.1.- Р.54-56.
  10. Lee P., Waalen J., Crain K. et.al. Human chitotriosidase polymorphisms G354R and A442V associated with reduced enzyme activity // Department of Molecular and Experimental Medicine.- 2007.- Vol.- 39.- Р. 353-360.
  11. Fadel F., Zhao Y., Cousido-Siah A. et.al. X-Ray Crystal Structure of the Full Length Human Chitotriosidase (CHIT1) Reveals Features of Its Chitin Binding Domain // PLoS One.- 2016.- Vol.11.- №.4.- Р.e0154190.
  12. Di Rosa M., Malaguarnera L. Chitotriosidase: A New Inflammatory Marker in Diabetic Complications // Pathobiology.- 2016.- Vol.83.- №.4.- Р. 211-219.
  13. С. В. Макаров, М. К. Карапетян, К. Б. Квеквескири и др. Полиморфизм гена CHIT1 в популяции абхазов и феномен долгожительства // Том 15,- № 1 (2016г).