Введение
От средних веков и до наших дней продолжаются поиски «элексира жизни». Алхимики искали «философский камень», нынче эскулапы заняты поисками чудодейственных лекарств и бальзамов, способных излечить от всех хворей и продлить жизнь.
При этом осмелюсь сказать, что каждому человеку хочется жить, быть здоровым и трудиться как можно дольше, не ощущая бремени старости.
Но, говорят, старость подкрадывается незаметно, и с этим ничего не поделаешь. При этом, стоит отметить, что в течение многих лет феномен старения рассматривался в рамках этических и социальных проблем.
Только за последнее столетие общество осознало, что процесс старения нужно исследовать в другом аспекте — как специальный физиологический механизм организма, имеющий определенное эволюционное значение.
Старение — самая сложная проблема медицины и биологии. Процесс старения — это постепенная инволюция тканей и нарушение функций организма.
Симптомы старости появляются уже в конце репродуктивного периода и становятся более интенсивными по мере дальнейшего старения.
Таким образом, старость это не процесс, а состояние организма подвергшегося старению.
А вот долголетие — это результат физиологической старости. Долголетие, при этом, определяется генетическим запасом прочности, которым обладает наш организм.
Нарушения в генетической программе развития в первую очередь ответственны за старение организма, в том числе и за преждевременную старость. Условия внешней среды оказывают влияние на продолжительность жизни, они могут укорачивать или продлевать ее, но лишь в пределах запрограммированной продолжительности жизни вида.
С возрастом происходит накопление повреждений, вызванных различными воздействиями на организм.
При этом выраженность таких воздействий индивидуальна.
В настоящее время процесс старения населения комплексно не изучен и не получил всесторонней оценки.
В связи с этим показано, что проблема старения является одной из самых важных и актуальных тем всего человечества.
Таким образом, проблемы старения и активного долголетия — это межотраслевая и междисциплинарная проблема, которая требует комплексного решения, внедрения любых «ноухау» технологий в систему здравоохранения, это в свою очередь, не обеспечивает сиюминутного достижения долголетия населения, так как это длительный процесс, требующий анализа, мониторинга и внедрения нано биотехнологий в систему здравоохранении.
Старение определяется как накопление прогрессирующей органной дисфункции. Существует много свидетельств, связывающих участие окислительного стресса в патогенезе старения. С возрастом повышается восприимчивость к развитию заболеваний, связанных с перекисным окислением липидов и повреждением тканей, обусловленным хроническими воспалительными процессами, а также выработкой активных форм кислорода (АФК) и свободных радикалов. Семейство генов параоксоназы играет ключевые роли в антиоксидантной защите против старения.
Одним из ферментов, которые ингибируют перекисное окисление липидов, является семейство параоксоназ, состоящее из параоксоназы-1 (PON-1), параоксоназы-2 (PON-2) и параоксоназы-3 (PON-3). Они вовлечены во многие заболевания, при которых важно перекисное окисление липидов, включая хронические воспалительные процессы, вызванные метаболическим окислительным стрессом [2,5,10]. PON-1 представляет собой функциональную составляющую частиц HDL; PON-2 существенно обнаруживает митохондрии и эндоплазматический ретикулум, тогда как PON-3 локализуется в HDL, митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме [2,5,10]. Многие исследования показали, что сывороточная активность PON-1 у лиц, страдающих от нескольких заболеваний (ишемия, хроническое заболевание почек, патологическое ожирение, дислипидемия), эстеразная активность фермента значительно снижается. Кроме того, было показано, что введение самого очищенного PON-1 уменьшает развитие воспалительных заболеваний кишечника и диабета как на модели на животных[3].
Концентрация и активность PON-1 в сыворотке очень различны у разных людей. Ферментативная сывороточная активность PON-1 у здоровых людей низкая в молодости, увеличивается со временем, остается стабильной на протяжении всей взрослой жизни и снижается у пожилых людей [4,7]. В процессе старения равновесие между окислительно-восстановительным состоянием и антиоксидантными агентами изменяется [6]. Эти изменения препятствуют регенерации клеток и тканей [13]. Дисбаланс в окислительно-восстановительном состоянии может быть связан с генетическими или эпигенетическими изменениями с увеличением провоспалительных цитокинов, неспособностью улавливать и использовать глюкозу в качестве источника энергии и повышенным окислением жирных кислот и липидов [8,10]. Изменения, связанные с окислительным метаболизмом липидов, являются одной из основных причин развития хронических заболеваний у пожилых людей, а также снижения продолжительности жизни [12]. Эти изменения могут вызывать генетические мутации, нормальный образ жизни, сбалансированное питание (богатое жирами, сахарами и углеводами), воспаление, изменение функций печени и почек, факторы, связанные с социальным взаимодействием и окружающей средой [15]. Среди защитных факторов против старения важны антиоксидантные ферменты, как описано ранее. Об ассоциации между ферментом PON-1 и старением клеток свидетельствует Lee et al., [9]. Экспрессия гена PON-1 человеческих микрососудистых эндотелиальных клеток в культуре ингибировалась интерферирующей РНК. Наблюдалось, что жизнеспособность клеток снижалась, и клетки вступали в старение с увеличением 2-галактозидазы и усилением клеточной морфологии. Другим важным результатом было значительное увеличение гидроперекисей белка. Гидропероксиды белков ингибируют тиолзависимые цистеиновые протеазы и протеинтирозинфосфазы [9]. Эти белки разрушают белки, поврежденные окислительными стрессовыми клетками, тканями и плазмой, и участвуют в активации и распространении в сигнальных путях окислительно-восстановительной системы. Следовательно, когда эти протеазы уменьшаются, окислительная передача сигналов усиливается, способствуя запуску процесса старения [9].
Таким образом, проведение молекулярно-генетических исследований долголетия открывает возможности для разработки эффективных мероприятий по профилактике старения, а, следовательно, и увеличения периода полноценной активной жизни человека. Изучение генетических особенностей долгожителей делает нашу работу весьма актуальной.
В связи с этим, цель наших исследований — изучение полиморфизма 192Q/R гена PON1 в популяционной выборке Кабардино-Балкарии.
Материалы и методы
В качестве материала исследования использовались образцы буккального эпителия и крови, собранных в ходе экспедиционных выездов по месту жительства исследуемых и в Республиканском Геронтологическом Центре в период 2012-2020 гг.
Данные о каждом участнике эксперимента обеих возрастных категорий были собраны путем анкетирования.
Формализованная карта-анкета заполнялась индивидуально на каждого участника исследования и соответствовала стандартной карте ВОЗ (1974).
В ходе исследования нами была продолжена работа по созданию банка биологического материала: цельная кровь, буккальный соскоб и ДНК долгожителей и средней возрастных групп, проживающих на территории Кабардино-Балкарской Республики.
Выборка долгожителей составила 39 человек от 90 до 104 лет, средний возраст выборки составил 93,02 года. Общая выборка старческой группы (80-89 лет) состояла из 53 человек (средний возраст 84,67 года).
Методы исследования
Клинические методы исследования: нами были обследованы 39 человек долгожителей и 53 человека старческой группы, проживающих в разных районах Кабардино-Балкарской Республики.
Данные каждого участника и биологические образцы были собраны с получением информированного согласия обследуемых или их законных представителей.
Участники проекта были полностью информированы обо всех аспектах своего участия в исследовании. Забор венозной крови проводился сертифицированной медицинской сестрой после предварительного анкетирования с участниками эксперимента или их представителями.
Забор буккального соскоба проводился самостоятельно стерильным зондом с перенесением образцов в индивидуальные стерильные пробирки.
Таким образом, были полностью соблюдены требования Хельсинской декларации 2008 года.
Система анкетирования с последующим формированием электронной базы данных, позволяла хранить материал, оперативно проводить дальнейший анализ, при потребности моделировать и прогнозировать ситуацию.
Лабораторные методы исследования
Для реализации поставленных целей и задач нашего исследования нами были использованы лабораторные методы исследования:
- выделение тотальной (геномной) ДНК;
- метод ПЦР;
- электрофоретическая детекция продуктов амплификации.
Лабораторные исследования были проведены на базе Медико–биологического центра КБГУ.
Лабораторное оборудование
В работе использовали лабораторное оборудование, необходимое для проведения молекулярно-генетических исследований такие как: ламинарный бокс (Германия), центрифуги (Eppendorf, Hittich, Германия), термостаты, спектрофотометр, вортекс (Eppendorf, Германия), прибор для горизонтального электрофореза (Bio- Rad, США), источник питания (ДНК-технология, Россия), амплификатор («БИС», Россия, Новосибирск), УФ-трансилюминатор с встроенной цифровой камерой, автоматические пипетки (Диа-М, Россия, Ерреndorf, Германия).
Молекулярно-генетические методы исследования
Для генотипирования полиморфных вариантов изучаемых генов-кандидатов были использованы препараты геномной ДНК. Аполиморфизма проводился методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим электрофорезом продуктов амплификации.
При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) был использован набор реагентов для проведения аллель-специфичной полимеразной реакции ООО НПФ «Литех».
Принцип метода заключается в том, что при полном совпадении последовательности специфических праймеров с комплементарной матрицей аллеля амплифицируется выбранная последовательность аллеля, а при несовпадении последнего нуклеотида на 3’-конце специфического праймера с комплементарной матрицей аллеля специфическая реакция не проходит. В этой же реакции используется пара неспецифических праймеров, которая является комплиментарной к обоим аллелям и служит внутренним контролем наличия ингибирования реакции. Каждый неспецифический праймер создает с одним из специфических пару и амплифицирует специфический ПЦР продукт определенного размера.
Определение точечной замены основано на присутствии или отсутствии специфического ПЦР продукта при обязательном наличии неспецифического ПЦР продукта определенного размера внутреннего контроля, который регистрируется с помощью электрофореза в 3% агарозном геле в УФ-свете при длине волны 312 нм.
Из компонентов комплекта были приготовлены рабочие смеси реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу:
- 19,5 мкл разбавителя,
- 2,5 мкл реакционной смеси,
- 0,2 мкл Taq-полимеразы.
Были приготовлены две рабочие смеси: с реакционной смесью НОРМА и с реакционной смесью МУТАЦИЯ. По 20 мкл соответствующей рабочей смеси добавили во все соответствующие пробирки, подготовленные для амплификации. Затем внесли во все пробирки по 1 капле (около 20 мкл) минерального масла и добавили по 3 мкл выделенного из образцов препаратов ДНК под слой масла.
Результаты и их обсуждение
Проведено изучение гена PON 1 по полиморфизму Gln192Arg у 92 индивидов, проживающих на территории Кабардино-Балкарии.
При генотипировании локуса PON 1 в исследуемых образцах ДНК нами было выявлено все три возможных генотипа данного гена. На электрофореграмме визуализируется (рис. 1) генотипы — Gln/Gln, Gln/Arg, Arg/Arg.

Частотный анализ генотипов и аллелей в общей выборке выявил, что гомозиготный генотип Gln*/Gln* встречается с частотой 39,14%, Gln*/ Arg гетерозиготный генотип — 47,82 %, гомозиготный генотип * Arg /Arg * — 13,04%.
Генотип | Общая частота полиморфного варианта | |
Общая выборка, N=92 человека | Частота генотипов и аллелей, р,% | |
Gln */Gln * | 36 | 39,14% |
*Gln /Arg * | 44 | 47,82% |
Arg */Arg * | 12 | 13,04% |
Аллель | ||
PON1Gln* | 116 | 63,1% |
PON1Arg* | 68 | 36,9% |
Частота аллелей PON1 Gln* и PON1 Arg* в общей популяции составила 63,1% и 36,9%, соответственно.
Эмпирически наблюдаемое распределение частот генотипов не отличается от теоретически ожидаемого по уравнению ХардиВайнберга (χ2=0,064, р0,05). Показатель гетерозиготности составил 47,8% (теоретическая гетерозиготность — 46,5%).
Сравнительный анализ полученных данных по частоте аллелей и генотипов с литературными данными показал, что популяционная выборка Кабардино-Балкарии показывают близость к европейским популяциям [1].
Для дальнейшего решения поставленных задач нами были сформированы две выборки:
- долгожители, средний возраст которых составлял 93,02±0,79 года. Выборка –39 человек;
- старческая возрастная группа — средней возраст –84,67±0,13. Выборка состояла из 53 человек.
Результаты генотипирования * Gln /Arg * полиморфизма гена PON1 в группах долгожителей и старческой возрастной группы представлены в таблице 2.
Генотип | Возрастная группа | |||
Старческая | Долгожители | |||
Общая выборка, N=53 человек | Частота генотипов и аллелей, p,% | Общая выборка, N=39 человек | Частота генотипов и аллелей, p,% | |
PON1 Gln */Gln * | 21 | 39,6 | 15 | 38,5 |
PON1 Gln */Arg* | 27 | 50,9 | 14 | 35,9 |
PON1 Arg */Arg * | 5 | 9,5 | 10 | 25,6 |
2 | χ2=4,76; P=0,093 | |||
Аллель | ||||
PON1* Gln | 69 | 69,5 | 44 | 56,4 |
PON1* Arg | 37 | 34,1 | 34 | 43,6 |
2 | χ2=1,43; P=0,0232 |
Анализ распределения частот генотипов в старческой возрастной группе выявил, что с наибольшей частотой выявлен генотип PON1 Gln*/Gln и составляет 39,6%, а генотип– PON1 Gln */Arg* 50,9% и генотип PON1Arg */Arg *выявлен с частотой 9,5%. Эмпирически наблюдаемое распределение частот генотипов в старческой группе не отличается от теоретически ожидаемого по уравнению ХардиВайнберга (χ2=0,77; Р=0,896).
В старческой возрастной группе аллели PON1*Gln и PON1*Arg представлены частотами 69,5% и 34,1%, соответственно.
В группе долгожителей генотип PON1 Gln*/*Gln был выявлен с частотой 38,5%, генотип–PON1 Gln*/Arg с частотой 35,9% и генотип PON1Arg */Arg *– 25,6%. Эмпирически наблюдаемое распределение частот генотипов в группе долгожителей не отличается от теоретически ожидаемого по уравнению ХардиВайнберга (χ2=0,77; Р=0,896).
В группе долгожителей аллель PON1 Gln* генотипирован с частотой 56,4% и аллель PON1 Arg * — 43,6%.
Сравнительный анализ частот по трем генотипам двух возрастных групп достоверно не отличался (χ2=4,76; P=0,093). Но при сравнении отдельных генотипов Gln*/ Arg* , гомозиготный генотип * Arg /Arg * , по которым видны различия, было выявлено значительное увеличение генотипа PON1 Arg */Arg * в группе долгожителей (25,6%), по сравнению со стариками (9,5%) (χ2=4,743; P=0,030), что соответствует литературным данным, а также что шансы достижения возраста долгожителей повышены у тех стариков, которые являются носителями генотипа PON1 Arg */Arg * [54].
Преобладающим в обеих возрастных группах был аллель PON1* Gln. Сравнительный анализ между группами стариков и долгожителей не выявил достоверных различий в распределении частот аллелей (χ2=1,43; P=0,0232).
Таким образом, популяционная выборка Кабардино-Балкарии показывает близость к европейским популяциям по частотам аллелей и генотипов по полиморфизму Gln192Arg гена PON 1. Выявлено значительное увеличение генотипа PON1 Arg */Arg * в группе долгожителей, по сравнению со стариками. Литературный анализ по данным частот аллелей и генотипов данного полиморфизма, показал, что среди долгожителей, итальянцев и ирландцев по этнической принадлежности, также увеличено число носителей аллеля PON1 Arg * [52]. Т.е. мы наблюдаем сходство результатовисследований на выборках долгожителей других этнических принадлежностей. Можно предположить, что полиморфизм гена PON1, в частности аллельный вариант PON1 Arg * (аллель R), важен для выживания в очень преклонном возрасте. Данные по ассоциации между аллелем R и долголетием остаются еще весьма противоречивыми. Однако некоторые авторы указывают, что из-за влияния различных генетических и/или экологических факторов маловероятно, что фенотипические эффекты генов идентичны в разных популяциях.
Гендерное распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма 192Q/R гена PON1
На следующем этапе наших исследований мы провели анализ частот аллелей и генотипов в выборке по гендерному признаку.
Распределение частот генотипов по полиморфизму Gln/Arg гена РОN1 по гендерному признаку представлено в таблице 3.
У мужчин и женщин общей выборки были выявлены все возможные генотипы данного полиморфизма. Эмпирически наблюдаемое распределение частот генотипов в общей выборке у мужчин (χ2=1,25; р0,05) и женщин (χ2=0,0129; р0,05) не отличались от теоретически ожидаемого по уравнению ХардиВайнберга.
Анализ распределения частот генотипов в выборке у мужчин и женщин выявил, что частота встречаемости генотип PON1 Gln*/Arg* у мужчин, меньше, чем у женщин (36,9% и 48,1%, соответственно), а генотип PON1 Gln */Gln* выше у мужчин по сравнению с женщинами (47,3% и 33,3%), соответственно. Генотип PON1 Arg*/Arg* у мужчин составил 15,8%, а у женщин — 18,6%. Но эти гендерные различия по частоте генотипов статистически не подтвердились (χ2=1,874; P=0,392).
Аллельный анализ не выявил статистически достоверной разницы между мужчинами и женщинами общей выборки Кабардино-Балкарии по полиморфизму Gln /Arg гена PON1 (2=1,316; n=1; p=0,252).
Гендерная принадлежность | Аллель/генотип | Частота, % (абс. ) | Значения χ2, p |
Муж –38 | PON1 Gln */Gln * | 47,3% (18 чел.) | χ2=1,874; P=0,392 |
PON1 Gln */Arg* | 36,9% (14 чел.) | ||
PON1 Arg */Arg | 15,8(6 чел.) | ||
Жен — 54 | PON1 Gln */Gln * | 33,3% (18 чел.) | |
PON1 Gln */Arg* | 48,1% (26 чел.) | ||
PON1 Gln */Gln * | 18,6% (10 чел.) | ||
Муж — 38 | PON1 Gln * | 65,7% (50 ал.) | 2=1,316; p=0,252 |
PON1 Arg * | 34,3% (26 ал.) | ||
Жен — 54 | PON1 Gln * | 57,4% ( 62 ал.) | |
PON1 Arg * | 42,6% (46 ал.) |
Таким образом, в результате проделанной работы по анализу частот аллелей и генотипов по полиморфизму Gln/Arg гена PON1 между мужчинами и женщинами в популяционной выборке индивидуумов 76-104 лет, проживающих в Кабардино-Балкарии, выявлено не было.
Частота встречаемости генотипов полиморфизма 192Q/R гена PON1 у представителей разных этнических групп
На следующем этапе наших исследований мы провели анализ частот встречаемости генотипов полиморфизма 192Q/R гена PON1 у представителей разных этнических групп.
Общая выборка из 92 человек была представлена: 48 индивидов кабардинской этнической принадлежности, 32 индивида балкарской этнической принадлежности и 12 русской этнической принадлежности. Для анализа были взяты две титульные этнические группы для Кабардино-Балкарии (таблица 4).
Этническая группа | Аллель/генотип | Частота, % (Количество человек) |
Кабардинцы — 48 | PON1Gln*/Gln* | 35,4% (17 чел.) |
PON1Gln*/Arg* | 50% (24 чел.) | |
PON1Arg*/Arg * | 14,6% (7 чел.) | |
Балкарцы — 32 | PON1Gln*/Gln* | 37,5% (12 чел.) |
PON1Gln*/Arg* | 46,9%(15 чел.) | |
PON1Arg*/Arg * | 15,6% (5 чел.) |
Эмпирически наблюдаемое распределение частот генотипов в кабардинской (χ2=0,098; Р0,05) и балкарской (χ2=0,098; Р0,05) популяциях не отличается от теоретически ожидаемого по уравнению ХардиВайнберга.
В кабардинской и балкарской популяциях генотипы встречались примерно с одинаковой частотой: Gln*/Gln* –35,4% и 37,5%, Gln*/Arg* — 50% и 46.9% и Arg*/Arg *– 14,6% и 15,6%, соответственно. Преобладающим в популяциях был гетерозиготный генотип. Имеющиеся различия были не достоверными (χ2=0,075; Р=0,965).
Проведенный частотный анализ аллелей полиморфизма 192Q/R гена PON1 у двух этнических групп (таблица 5) показал, что преобладающим аллелем у кабардинцев и балкарцев был вариант PON1 Gln* — 60,4% и 60,9%, соответственно. Достоверных различий по частотам аллелей данного полиморфизма между популяциями получено не было (χ2=0,004; Р=0,948).
Этническая группа | Аллель/генотип | Частота, % (Количество аллелей) |
Кабардинцы — 48 | PON1Gln* | 60,4% (58 ал.) |
PON1Arg* | 39,6% (38 ал.) | |
Балкарцы — 32 | PON1Gln* | 60,9% (39 ал.) |
PON1Arg* | 39,1% (25 ал.) |
Таким образом, проведенный анализ частот аллелей и генотипов по полиморфизму 192Q/R гена PON1 в кабардинской и балкарской популяциях не выявил этнических особенностей. Популяции показали высокую схожесть по данным показателям, а также схожесть с литературными данными в популяции итальянцев и ирландцев [52].