Анализ возрастной динамики частот аллелей и генотипов по полиморфизму 192Q/R гена PON1

Введение

От средних веков и до наших дней продолжаются поиски «элексира жизни». Алхимики искали «философский камень», нынче эскулапы заняты поисками чудодейственных лекарств и бальзамов, способных излечить от всех хворей и продлить жизнь.

При этом осмелюсь сказать, что каждому человеку хочется жить, быть здоровым и трудиться как можно дольше, не ощущая бремени старости.

Но, говорят, старость подкрадывается незаметно, и с этим ничего не поделаешь. При этом, стоит отметить, что в течение многих лет феномен старения рассматривался в рамках этических и социальных проблем.

Только за последнее столетие общество осознало, что процесс старения нужно исследовать в другом аспекте — как специальный физиологический механизм организма, имеющий определенное эволюционное значение.

Старение — самая сложная проблема медицины и биологии. Процесс старения — это постепенная инволюция тканей и нарушение функций организма.

Симптомы старости появляются уже в конце репродуктивного периода и становятся более интенсивными по мере дальнейшего старения.

Таким образом, старость это не процесс, а состояние организма подвергшегося старению.

А вот долголетие — это результат физиологической старости. Долголетие, при этом, определяется генетическим запасом прочности, которым обладает наш организм.

Нарушения в генетической программе развития в первую очередь ответственны за старение организма, в том числе и за преждевременную старость. Условия внешней среды оказывают влияние на продолжительность жизни, они могут укорачивать или продлевать ее, но лишь в пределах запрограммированной продолжительности жизни вида.

С возрастом происходит накопление повреждений, вызванных различными воздействиями на организм.

При этом выраженность таких воздействий индивидуальна.

В настоящее время процесс старения населения комплексно не изучен и не получил всесторонней оценки.

В связи с этим показано, что проблема старения является одной из самых важных и актуальных тем всего человечества.

Таким образом, проблемы старения и активного долголетия — это межотраслевая и междисциплинарная проблема, которая требует комплексного решения, внедрения любых «ноухау» технологий в систему здравоохранения, это в свою очередь, не обеспечивает сиюминутного достижения долголетия населения, так как это длительный процесс, требующий анализа, мониторинга и внедрения нано биотехнологий в систему здравоохранении.

Старение определяется как накопление прогрессирующей органной дисфункции. Существует много свидетельств, связывающих участие окислительного стресса в патогенезе старения. С возрастом повышается восприимчивость к развитию заболеваний, связанных с перекисным окислением липидов и повреждением тканей, обусловленным хроническими воспалительными процессами, а также выработкой активных форм кислорода (АФК) и свободных радикалов. Семейство генов параоксоназы играет ключевые роли в антиоксидантной защите против старения.

Одним из ферментов, которые ингибируют перекисное окисление липидов, является семейство параоксоназ, состоящее из параоксоназы-1 (PON-1), параоксоназы-2 (PON-2) и параоксоназы-3 (PON-3). Они вовлечены во многие заболевания, при которых важно перекисное окисление липидов, включая хронические воспалительные процессы, вызванные метаболическим окислительным стрессом [2,5,10]. PON-1 представляет собой функциональную составляющую частиц HDL; PON-2 существенно обнаруживает митохондрии и эндоплазматический ретикулум, тогда как PON-3 локализуется в HDL, митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме [2,5,10]. Многие исследования показали, что сывороточная активность PON-1 у лиц, страдающих от нескольких заболеваний (ишемия, хроническое заболевание почек, патологическое ожирение, дислипидемия), эстеразная активность фермента значительно снижается. Кроме того, было показано, что введение самого очищенного PON-1 уменьшает развитие воспалительных заболеваний кишечника и диабета как на модели на животных[3].

Концентрация и активность PON-1 в сыворотке очень различны у разных людей. Ферментативная сывороточная активность PON-1 у здоровых людей низкая в молодости, увеличивается со временем, остается стабильной на протяжении всей взрослой жизни и снижается у пожилых людей [4,7]. В процессе старения равновесие между окислительно-восстановительным состоянием и антиоксидантными агентами изменяется [6]. Эти изменения препятствуют регенерации клеток и тканей [13]. Дисбаланс в окислительно-восстановительном состоянии может быть связан с генетическими или эпигенетическими изменениями с увеличением провоспалительных цитокинов, неспособностью улавливать и использовать глюкозу в качестве источника энергии и повышенным окислением жирных кислот и липидов [8,10]. Изменения, связанные с окислительным метаболизмом липидов, являются одной из основных причин развития хронических заболеваний у пожилых людей, а также снижения продолжительности жизни [12]. Эти изменения могут вызывать генетические мутации, нормальный образ жизни, сбалансированное питание (богатое жирами, сахарами и углеводами), воспаление, изменение функций печени и почек, факторы, связанные с социальным взаимодействием и окружающей средой [15]. Среди защитных факторов против старения важны антиоксидантные ферменты, как описано ранее. Об ассоциации между ферментом PON-1 и старением клеток свидетельствует Lee et al., [9]. Экспрессия гена PON-1 человеческих микрососудистых эндотелиальных клеток в культуре ингибировалась интерферирующей РНК. Наблюдалось, что жизнеспособность клеток снижалась, и клетки вступали в старение с увеличением 2-галактозидазы и усилением клеточной морфологии. Другим важным результатом было значительное увеличение гидроперекисей белка. Гидропероксиды белков ингибируют тиолзависимые цистеиновые протеазы и протеинтирозинфосфазы [9]. Эти белки разрушают белки, поврежденные окислительными стрессовыми клетками, тканями и плазмой, и участвуют в активации и распространении в сигнальных путях окислительно-восстановительной системы. Следовательно, когда эти протеазы уменьшаются, окислительная передача сигналов усиливается, способствуя запуску процесса старения [9].

Таким образом, проведение молекулярно-генетических исследований долголетия открывает возможности для разработки эффективных мероприятий по профилактике старения, а, следовательно, и увеличения периода полноценной активной жизни человека. Изучение генетических особенностей долгожителей делает нашу работу весьма актуальной.

В связи с этим, цель наших исследований — изучение полиморфизма 192Q/R гена PON1 в популяционной выборке Кабардино-Балкарии.

Материалы и методы

В качестве материала исследования использовались образцы буккального эпителия и крови, собранных в ходе экспедиционных выездов по месту жительства исследуемых и в Республиканском Геронтологическом Центре в период 2012-2020 гг.

Данные о каждом участнике эксперимента обеих возрастных категорий были собраны путем анкетирования.

Формализованная карта-анкета заполнялась индивидуально на каждого участника исследования и соответствовала стандартной карте ВОЗ (1974).

В ходе исследования нами была продолжена работа по созданию банка биологического материала: цельная кровь, буккальный соскоб и ДНК долгожителей и средней возрастных групп, проживающих на территории Кабардино-Балкарской Республики.

Выборка долгожителей составила 39 человек от 90 до 104 лет, средний возраст выборки составил 93,02 года. Общая выборка старческой группы (80-89 лет) состояла из 53 человек (средний возраст 84,67 года).

Методы исследования

Клинические методы исследования: нами были обследованы 39 человек долгожителей и 53 человека старческой группы, проживающих в разных районах Кабардино-Балкарской Республики.

Данные каждого участника и биологические образцы были собраны с получением информированного согласия обследуемых или их законных представителей.

Участники проекта были полностью информированы обо всех аспектах своего участия в исследовании. Забор венозной крови проводился сертифицированной медицинской сестрой после предварительного анкетирования с участниками эксперимента или их представителями.

Забор буккального соскоба проводился самостоятельно стерильным зондом с перенесением образцов в индивидуальные стерильные пробирки.

Таким образом, были полностью соблюдены требования Хельсинской декларации 2008 года.

Система анкетирования с последующим формированием электронной базы данных, позволяла хранить материал, оперативно проводить дальнейший анализ, при потребности моделировать и прогнозировать ситуацию.

Лабораторные методы исследования

Для реализации поставленных целей и задач нашего исследования нами были использованы лабораторные методы исследования:

• выделение тотальной (геномной) ДНК;
• метод ПЦР;
• электрофоретическая детекция продуктов амплификации.

Лабораторные исследования были проведены на базе Медико–биологического центра КБГУ.

Лабораторное оборудование

В работе использовали лабораторное оборудование, необходимое для проведения молекулярно-генетических исследований такие как: ламинарный бокс (Германия), центрифуги (Eppendorf, Hittich, Германия), термостаты, спектрофотометр, вортекс (Eppendorf, Германия), прибор для горизонтального электрофореза (Bio- Rad, США), источник питания (ДНК-технология, Россия), амплификатор («БИС», Россия, Новосибирск), УФ-трансилюминатор с встроенной цифровой камерой, автоматические пипетки (Диа-М, Россия, Ерреndorf, Германия).

Молекулярно-генетические методы исследования

Для генотипирования полиморфных вариантов изучаемых генов-кандидатов были использованы препараты геномной ДНК. Аполиморфизма проводился методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим электрофорезом продуктов амплификации.

При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) был использован набор реагентов для проведения аллель-специфичной полимеразной реакции ООО НПФ «Литех».

Принцип метода заключается в том, что при полном совпадении последовательности специфических праймеров с комплементарной матрицей аллеля амплифицируется выбранная последовательность аллеля, а при несовпадении последнего нуклеотида на 3’-конце специфического праймера с комплементарной матрицей аллеля специфическая реакция не проходит. В этой же реакции используется пара неспецифических праймеров, которая является комплиментарной к обоим аллелям и служит внутренним контролем наличия ингибирования реакции. Каждый неспецифический праймер создает с одним из специфических пару и амплифицирует специфический ПЦР продукт определенного размера.

Определение точечной замены основано на присутствии или отсутствии специфического ПЦР продукта при обязательном наличии неспецифического ПЦР продукта определенного размера внутреннего контроля, который регистрируется с помощью электрофореза в 3% агарозном геле в УФ-свете при длине волны 312 нм.

Из компонентов комплекта были приготовлены рабочие смеси реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу:

• 19,5 мкл разбавителя,
• 2,5 мкл реакционной смеси,
• 0,2 мкл Taq-полимеразы.

Были приготовлены две рабочие смеси: с реакционной смесью НОРМА и с реакционной смесью МУТАЦИЯ. По 20 мкл соответствующей рабочей смеси добавили во все соответствующие пробирки, подготовленные для амплификации. Затем внесли во все пробирки по 1 капле (около 20 мкл) минерального масла и добавили по 3 мкл выделенного из образцов препаратов ДНК под слой масла.

Результаты и их обсуждение

Проведено изучение гена PON 1 по полиморфизму Gln192Arg у 92 индивидов, проживающих на территории Кабардино-Балкарии.

При генотипировании локуса PON 1 в исследуемых образцах ДНК нами было выявлено все три возможных генотипа данного гена. На электрофореграмме визуализируется (рис. 1) генотипы — Gln/Gln, Gln/Arg, Arg/Arg.

Частотный анализ генотипов и аллелей в общей выборке выявил, что гомозиготный генотип Gln*/Gln* встречается с частотой 39,14%, Gln*/ Arg гетерозиготный генотип — 47,82 %, гомозиготный генотип * Arg /Arg * — 13,04%.

Частота аллелей PON1 Gln* и PON1 Arg* в общей популяции составила 63,1% и 36,9%, соответственно.

Эмпирически наблюдаемое распределение частот генотипов не отличается от теоретически ожидаемого по уравнению ХардиВайнберга (χ²=0,064, р0,05). Показатель гетерозиготности составил 47,8% (теоретическая гетерозиготность — 46,5%).

Сравнительный анализ полученных данных по частоте аллелей и генотипов с литературными данными показал, что популяционная выборка Кабардино-Балкарии показывают близость к европейским популяциям [1].

Для дальнейшего решения поставленных задач нами были сформированы две выборки:

• долгожители, средний возраст которых составлял 93,02±0,79 года. Выборка –39 человек;
• старческая возрастная группа — средней возраст –84,67±0,13. Выборка состояла из 53 человек.

Результаты генотипирования * Gln /Arg * полиморфизма гена PON1 в группах долгожителей и старческой возрастной группы представлены в таблице 2.

Анализ распределения частот генотипов в старческой возрастной группе выявил, что с наибольшей частотой выявлен генотип PON1 Gln*/Gln и составляет 39,6%, а генотип– PON1 Gln */Arg* 50,9% и генотип PON1Arg */Arg *выявлен с частотой 9,5%. Эмпирически наблюдаемое распределение частот генотипов в старческой группе не отличается от теоретически ожидаемого по уравнению ХардиВайнберга (χ2=0,77; Р=0,896).

В старческой возрастной группе аллели PON1*Gln и PON1*Arg представлены частотами 69,5% и 34,1%, соответственно.

В группе долгожителей генотип PON1 Gln*/*Gln был выявлен с частотой 38,5%, генотип–PON1 Gln*/Arg с частотой 35,9% и генотип PON1Arg */Arg *– 25,6%. Эмпирически наблюдаемое распределение частот генотипов в группе долгожителей не отличается от теоретически ожидаемого по уравнению ХардиВайнберга (χ2=0,77; Р=0,896).

В группе долгожителей аллель PON1 Gln* генотипирован с частотой 56,4% и аллель PON1 Arg * — 43,6%.

Сравнительный анализ частот по трем генотипам двух возрастных групп достоверно не отличался (χ²=4,76; P=0,093). Но при сравнении отдельных генотипов Gln*/ Arg* , гомозиготный генотип * Arg /Arg * , по которым видны различия, было выявлено значительное увеличение генотипа PON1 Arg */Arg * в группе долгожителей (25,6%), по сравнению со стариками (9,5%) (χ²=4,743; P=0,030), что соответствует литературным данным, а также что шансы достижения возраста долгожителей повышены у тех стариков, которые являются носителями генотипа PON1 Arg */Arg * [54].

Преобладающим в обеих возрастных группах был аллель PON1* Gln. Сравнительный анализ между группами стариков и долгожителей не выявил достоверных различий в распределении частот аллелей (χ²=1,43; P=0,0232).

Таким образом, популяционная выборка Кабардино-Балкарии показывает близость к европейским популяциям по частотам аллелей и генотипов по полиморфизму Gln192Arg гена PON 1. Выявлено значительное увеличение генотипа PON1 Arg */Arg * в группе долгожителей, по сравнению со стариками. Литературный анализ по данным частот аллелей и генотипов данного полиморфизма, показал, что среди долгожителей, итальянцев и ирландцев по этнической принадлежности, также увеличено число носителей аллеля PON1 Arg * [52]. Т.е. мы наблюдаем сходство результатовисследований на выборках долгожителей других этнических принадлежностей. Можно предположить, что полиморфизм гена PON1, в частности аллельный вариант PON1 Arg * (аллель R), важен для выживания в очень преклонном возрасте. Данные по ассоциации между аллелем R и долголетием остаются еще весьма противоречивыми. Однако некоторые авторы указывают, что из-за влияния различных генетических и/или экологических факторов маловероятно, что фенотипические эффекты генов идентичны в разных популяциях.

Гендерное распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма 192Q/R гена PON1

На следующем этапе наших исследований мы провели анализ частот аллелей и генотипов в выборке по гендерному признаку.

Распределение частот генотипов по полиморфизму Gln/Arg гена РОN1 по гендерному признаку представлено в таблице 3.

У мужчин и женщин общей выборки были выявлены все возможные генотипы данного полиморфизма. Эмпирически наблюдаемое распределение частот генотипов в общей выборке у мужчин (χ2=1,25; р0,05) и женщин (χ2=0,0129; р0,05) не отличались от теоретически ожидаемого по уравнению ХардиВайнберга.

Анализ распределения частот генотипов в выборке у мужчин и женщин выявил, что частота встречаемости генотип PON1 Gln*/Arg* у мужчин, меньше, чем у женщин (36,9% и 48,1%, соответственно), а генотип PON1 Gln */Gln* выше у мужчин по сравнению с женщинами (47,3% и 33,3%), соответственно. Генотип PON1 Arg*/Arg* у мужчин составил 15,8%, а у женщин — 18,6%. Но эти гендерные различия по частоте генотипов статистически не подтвердились (χ²=1,874; P=0,392).

Аллельный анализ не выявил статистически достоверной разницы между мужчинами и женщинами общей выборки Кабардино-Балкарии по полиморфизму Gln /Arg гена PON1 (²=1,316; n=1; p=0,252).

Таким образом, в результате проделанной работы по анализу частот аллелей и генотипов по полиморфизму Gln/Arg гена PON1 между мужчинами и женщинами в популяционной выборке индивидуумов 76-104 лет, проживающих в Кабардино-Балкарии, выявлено не было.

Частота встречаемости генотипов полиморфизма 192Q/R гена PON1 у представителей разных этнических групп

На следующем этапе наших исследований мы провели анализ частот встречаемости генотипов полиморфизма 192Q/R гена PON1 у представителей разных этнических групп.

Общая выборка из 92 человек была представлена: 48 индивидов кабардинской этнической принадлежности, 32 индивида балкарской этнической принадлежности и 12 русской этнической принадлежности. Для анализа были взяты две титульные этнические группы для Кабардино-Балкарии (таблица 4).

Эмпирически наблюдаемое распределение частот генотипов в кабардинской (χ2=0,098; Р0,05) и балкарской (χ2=0,098; Р0,05) популяциях не отличается от теоретически ожидаемого по уравнению ХардиВайнберга.

В кабардинской и балкарской популяциях генотипы встречались примерно с одинаковой частотой: Gln*/Gln* –35,4% и 37,5%, Gln*/Arg* — 50% и 46.9% и Arg*/Arg *– 14,6% и 15,6%, соответственно. Преобладающим в популяциях был гетерозиготный генотип. Имеющиеся различия были не достоверными (χ2=0,075; Р=0,965).

Проведенный частотный анализ аллелей полиморфизма 192Q/R гена PON1 у двух этнических групп (таблица 5) показал, что преобладающим аллелем у кабардинцев и балкарцев был вариант PON1 Gln* — 60,4% и 60,9%, соответственно. Достоверных различий по частотам аллелей данного полиморфизма между популяциями получено не было (χ2=0,004; Р=0,948).

Таким образом, проведенный анализ частот аллелей и генотипов по полиморфизму 192Q/R гена PON1 в кабардинской и балкарской популяциях не выявил этнических особенностей. Популяции показали высокую схожесть по данным показателям, а также схожесть с литературными данными в популяции итальянцев и ирландцев [52].