Методом ИК-спектроскопии было изучено взаимодействие НЛЦС (нативный лигноцеллюлозный субстрат — смесь чистых опилок различных древесных пород, чистая подстилка) с мицелиальным грибом — целлюлозодеструктором Aspergillus niger 412.
НЛЦС был предобработан естественными отходами коневодства (ПЛЦС — пред-обработанный лигноцеллюлозный субстрат — смесь опилок различных древесных пород и перепрелого конского навоза, грязная подстилка). Изменения в ИК-спектрах образцов свидетельствуют о процессе биотрансформации конской подстилки с накоплением белка. Полученные результаты могут быть положены в основу создания экологически чистой технологии утилизации отходов коневодства и коннозаводства.
Грязная конская подстилка образуется в конехозяйствах (конных заводах, ипподромах, конноспортивных секциях и др.) в значительных количествах и подлежит утилизации. При этом возникают экологические проблемы, о которых сообщалось в обзоре [1].
О масштабах образования грязной подстилки свидетельствуют следующие данные: норма расхода подстилки в сутки (в денниках подстилка меняется ежедневно!) для жеребцов-производителей всех заводских пород — 5 кг сухой соломы или 15 кг сухих древесных опилок [2, 3]. Суточная норма расхода подстилки при денниковом содержании заводских кобыл, конематок, а также молодняка после отъема — еще больше — 6 кг сухой соломы или 18 кг сухих древесных опилок [2,3].
В настоящее время проблема утилизации грязной конской подстилки является до конца нерешенной. Преимущества микробиологических способов переработки лигноцеллюлозных субстратов (ЛЦС) по сравнению с экологически опасными способами, такими, как сжигание и запахивание [4], рассматривались нами ранее [5].
Важной характеристикой процесса биотрансформации является степень утилизации субстрата по целлюлозе и лигнину. Однако традиционные биохимические методы для определения этих характеристик являются трудоемкими и требуют значительных временных затрат [6, 7].
Представляется интересным исследовать процесс биотрансформации при помощи физических методов. Так, в работе [8] сообщается о применении рентгеноструктурного анализа (РСА) для изучения строения кристаллической целлюлозы и ее изменений в процессе ферментативного гидролиза.
Нами был использован метод ИК-спектроскопии для определения качественных и количественных изменений в чистой и грязной конской подстилках (НЛЦС и ПЛЦС, соответственно) в процессе её биотрансформации.
Обсуждение экспериментальных результатов
Гидроксо–группы целлюлозы образуют межмолекулярные водородные связи, вследствие чего полосы поглощения ν (-ОН асс.) широкие и сдвинуты в длинноволновую область.
Углекислый газ (О=С=О) — продукт брожения (образец 3) (см. Таблицу 1), а также продукт жизнедеятельности микромицетов (образцы 2,4).
№ образца | Наименование образца | ν, см-1 | Молекулярный фрагмент |
1 | НЛЦС | 3300 2910 1740 1640 | -ОН (асс.) С-Н С=О С=С (аром.) |
2 | Продукт биоконверсии НЛЦС с микромицетом Aspergillus niger 412 | 3300 2930 2340 1740 1610 | -ОН (асс.) С-Н О=С=О (газ.) С=О С=С (аром.) |
3 | ПЛЦС | 3390 2930 2340 1680 1600 | -NH-(асс.), -ОН (асс.) наложение полос С-Н О=С=О (газ.) С=О С=С (аром.) |
4 | Продукт биоконверсии ПЛЦС с микромицетом Aspergillus niger 412 | 3390 2940 2340 1740 1600 | -NH-(асс.), -ОН (асс.) наложение полос С-Н О=С=О (газ.) С=О С=С (аром.) |
Анализ ИК-спектров показывает, что во всех случаях в продуктах биоконверсии ЛЦС уменьшилось количество гидроксо-групп. Следовательно, происходит частичная утилизация целлюлозы микромицетами.
В образце 3 (ПЛЦС, грязная подстилка) резко уменьшилось количество С=С (аром.) — связей (уменьшение содержания лигнина) по сравнению с образцами 1 (НЛЦС, чистая подстилка) и 2 (продукт биоконверсии НЛЦС).
В процессе биоконверсии гриб Aspergillus niger 412 «предпочитает» усваивать кислородсодержащие молекулярные фрагменты — их содержание в образце 4 (продукте биоконверсии ПЛЦС) значительно ниже, чем в образце 3.
Также следует отметить, что степень утилизации субстратов в результате биотрансформации составила более 85%. Определение проводили по методу Апдеграффа с использованием антронового реактива [7].
Экспериментальная часть
ИК-спектры образцов (таблетки с КВr) регистрировались на спектрофотометре «ИКС-29», область записи спектров: 4200-400 см-1 .
ЛЦС: НЛЦС взят из конюшни конноспортивной секции Санкт-Петербургского мясокомбината (СПбМК) (г. Санкт-Петербург, стадион СПбМК, Средняя Рогатка, Московское шоссе, д.3); ПЛЦС взят из манежа стадиона СПбМК.
Перед культивированием ЛЦС были простерилизованы в течение 30 мин. при 0,8 атм.
Микроорганизмы: штамм мицелиального гриба Aspergillus niger 412 из коллекции кафедры молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета).
Культура поддерживалась на косяках с агаризованной средой Чапека-Докса, содержащей в качестве единственного источника углерода ЛЦС.
Ферментацию осуществляли методом глубинного культивирования в колбах Эрленмейера ёмкостью 750 мл, объём питательной среды в колбах — 100 мл.
Состав среды:
- калия дигидрофосфат КН2РО4 — 2,0 г/л;
- аммония нитрат NН4NО3 — 5,0 г/л;
- магния сульфат, гептагидрат МgSO4.7 H2O — 0,5 г/л;
- ЛЦС — 2,0 г/л.
Количество посевного материала — 10% по объёму. Температура культивирования +28 °C. Перемешивание проводилось на качалке при 200 об/мин. Время культивирования Aspergillus niger 412 — 96 ч.
После культивирования образцы были отмыты дистиллированной водой и высушены до постоянного веса при 105 °C, измельчены и спрессованы в таблетки с КВr (5 мг сухого вещества на 50 мг КВr) для регистрации ИК-спектров.
Выводы
- Метод ИК-спектроскопии позволяет оценить количественные и качественные изменения в чистой и грязной конской подстилках в процессе её биотрансформации;
- Предобработка чистой конской подстилки естественными отходами конехозяйств позволяет утилизировать целлюлозу и лигнин, что создает благоприятные предпосылки для разработки экологически безопасных технологий утилизации отходов коневодства и коннозаводства.